载miR-30a超声微泡对乳腺癌细胞上皮-间质转化进程的影响

叶兰 凌晨

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率占所有恶性肿瘤的9%～10%，恶性程度与肿瘤转移是造成患者死亡的主要原因。恶性肿瘤的转移进程中上皮-间质转化（EMT）发挥着关键的调节作用，癌细胞表型发生频繁的暂时性、异质性改变，表观遗传调控可部分解释癌细胞表型灵活转变的特性，其中microRNAs（miRNAs）的转录后调控机制起着重要作用［1-2］。miR-30a可通过靶向ZEB2［3］和SLUG［4］抑制乳腺癌细胞的恶性转化以及EMT进程。超声（US）成像技术是一种实时成像技术，造影剂微泡优先分布于肿瘤中丰富的微血管，从而进行肿瘤显影［5］。近年来，超声靶向微泡破坏（UTMD）作为药物和基因的递载系统，体现出巨大的潜力，引起众多研究者的重视。笔者拟利用UTMD技术在体外研究miR-30a递载进入乳腺癌细胞后对癌细胞EMT进程的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购于中科院上海细胞库，细胞贴壁培养于含15%胎牛血清的L-15培养液中，在37 ℃、5% CO2的细胞恒温培养箱中常规培养。

1.2 试剂与仪器 SonoVue购于博莱科公司，细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，Bcl-2抗体、Ki-67抗体、cl-caspase-3抗体、Vimentin抗体、N-cadherin抗体、Slug抗体、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，荧光素酶报告质粒载体由南京金斯瑞生物科技公司构建，流式细胞分析仪购自美国BD Bioscience公司，实时荧光定量PCR为瑞士Roche公司生产，Envision分析仪由美国PerkinElmer公司生产。

1.3 微泡制备和UTMD转染 SonoVue瓶内注射5 mL无菌生理盐水，振荡至全部分散。6孔板培养MCF-7细胞，按照次日达到70%接种密度进行传代培养，过夜培养后，用SonoVue进行转染，分为4组，每组3孔细胞。Cells组：无处理；Cells+US+miR-30a组：细胞中加入50 nM miR-30a，均匀分散后，以1 MHz频率、1 W/cm2辐照功率超声30 sec；Cells+MB+miR-30a组：细胞中加入等量 miR-30a，加入20%原始浓度SonoVue；Cells+UTMD+miR-30a组：细胞中加入等量miR-30a和SonoVue，以1 MHz频率、1 W/cm2辐照功率超声30 sec。

1.4 实时荧光定量PCR实验 采用SYBR Green荧光定量PCR法检测miR-30a和Slug的基因含量，严格按照Invitrogen说明书进行操作，Trizol试剂提取总RNA，经逆转录成cDNA后，对各基因表达量进行检测，引物由苏州瑞赢生物公司合成。miR-30a引物 上 游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'，下游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'， 以U6为内参，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'，下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。Slug引 物上 游：5'-TCCTGGTCAAGAAGCATT-3'，下 游：5'- GAGGAGGTGTCAGATGGA-3'，以ACTB为内参，上游： 5'-ACTCGTCATACTCCTGCT-3'，下 游：5'-GAA ACTACCTTCAACTCC -3'。采用2-ΔΔt法计算目标基因相对内参基因的相对倍数，各实验均重复3次。

1.5 细胞凋亡检测 各组加药处理48 h后，采用胰蛋白酶收集悬浮细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书操作，以流式细胞仪检测细胞凋亡百分比，计算早期、晚期凋亡率之和，实验重复3次。

1.6 目的蛋白的Western Blot检测 采用胰蛋白酶收集细胞，经细胞裂解液冰上裂解后，再经BCA试剂盒测定总蛋白浓度。每组取30 μg蛋白经变性和loading后，上样进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，再经PVDF转膜蛋白印迹。用5%脱脂奶粉封闭后，再经一抗孵育过夜（4 ℃），再经二抗室温孵育1 h，加ECL显影液显色，再由成像分析仪测量各条带光密度，计算各条带相对内参蛋白的相对表达水平。

1.7 双荧光素酶报告基因实验 根据miR-30a和Slug 3'-UTR结合位点设计wt Slug 3'-UTR和mut Slug 3'-UTR，克隆至荧光素酶报告质粒载体psiCHECK2上，然后将其和miR-30a mimic、miR-NC共同转染到MDAMB-231细胞中，按照lipofectamin3000试剂盒说明书进行操作。转染24 h后，检测海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性值的比值，作为miR-30a同Slug的结合力。

1.8 Transwell细胞侵袭实验 采用胰蛋白酶消化各组细胞，调整至105个/孔，每个小室的上室（含基质胶）内加入100 μL细胞，下室内加入700 μL完全培养液，过夜培养后用棉签拭去上室上表面细胞，下表面经甲醇固定、结晶紫染色后封片，显微镜下计数下表面附着的细胞，并计算相对侵袭力。

2 结果

2.1 UTMD转染效率鉴定 采用qRT-PCR技术鉴定各组miR-30a的表达水平，结果显示Cells+UTMD+miR-30a组的miR-30a表达水平明显高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05），而Cells组、Cells+US+miR-30a组、Cells+MB+miR-30a组之间miR-30a水平无统计差异（P>0.05）。见图1。

图1 4组MCF-7细胞中miR-30a的表达水平

2.2 UTMD递送的miR-30a促进MCF-7细胞凋亡 细胞凋亡结果显示，Cells组、Cells+US+miR-30a组、Cells+MB+miR-30a组、Cells+UTMD+miR-30a组 的细 胞 凋亡率分别为（3.2±1.4）%、（4.8±2.1）%、（3.5±1.1）%、（20.2±3.2）%，Cells+UTMD+miR-30a组的细胞凋亡率显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05），其余三组之间无统计学差异（P>0.05），见图2A。进一步检测各组的凋亡相关和增殖相关蛋白表达，可见癌基因Bcl-2和增殖相关基因Ki-67的蛋白表达水平在Cells+UTMD+miR-30a组中明显降低，凋亡执行者cl-caspase-3的蛋白表达水平在Cells+UTMD+miR-30a组中明显增加，与其余三组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），而3个蛋白的表达水平在其余三组中比较无统计学差异（P>0.05），见图2B。

图2 4组MCF-7细胞凋亡水平和凋亡/增殖相关蛋白的表达

2.3 miR-30直接靶向结合Slug 首先采用miRanda、miRWalk和TargetScan预测miR-30a和Slug的靶向结合位点，Slug 3'-UTR包含两处进化保守的结构域，同miR-30a具有互补性，然后对Slug 3'-UTR的结合位点进行突变，见图3A，通过双荧光素酶实验证实，同时转染miR-30a mimic和Slug-wt的细胞的荧光素酶活性最低，同其他转染组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见图3B。进一步用UTMD递送miR-30a，并检测细胞中Slug的基因表达水平，可见同Cells组、Cells+US+miR-30a组、Cells+MB+miR-30a组相比，Cells+UTMD+miR-30a组的Slug基因表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见图3C。

图3 miR-30a同Slug 3'-UTR的靶向关系检测

2.4 miR-30抑制细胞侵袭和EMT 与Cells组相比，Cells+UTMD+miR-30a组的细胞侵袭力显著降低（P<0.05），而Cells+US+miR-30a组、Cells+MB+miR-30a组无显著变化（P>0.05），见图4A。进一步对EMT进程标志蛋白Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平进行检测，可见Cells+UTMD+miR-30a组中，Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），而其余3组比较差异无明显统计学差异（P>0.05），同时，Cells+UTMD+miR-30a组的Slug蛋白表达水平也显著降低（P<0.05）。

图4 4组MCF-7细胞侵袭能力和EMT能力检测

3 讨论

乳腺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和内分泌治疗等，肿瘤转移是导致复发、治疗失败的主要原因，25%～50%的乳腺癌患者最终会出现转移，从而增加死亡风险［6］，故而乳腺癌的转移机制研究是研发治疗药物的基础。随着基因技术的发展，基因治疗有可能成为治疗乳腺癌的有效方法之一，但体内基因转染的方法具有一定局限性，病毒虽然转染效率高，但容易发生脱靶反应，有着安全性的疑虑；而质粒的分子量巨大，会造成有效剂量低、靶点效率不高。研究证实，miRNA可能对乳腺癌恶化和转移的预测、诊断、治疗及患者预后具有一定指导价值，有效剂量、靶向性等方面均具有显著优势，但受限于递送方法的影响，易被体内广泛分布的RNA酶水解。

本研究通过观察超声靶向微泡破坏（UTMD）技术递送miRNA至体外人乳腺癌细胞的效果，探讨miR-30a抑制乳腺癌细胞生存、侵袭的能力及其作用机制。结果显示，单独超声或单独微泡处理，并不能将miR-30a转染进入乳腺癌细胞，但超声和微泡联合使用时，miR-30a可被转染进入癌细胞，且其在细胞中的表达水平显著提高，说明UTMD技术可以增强基因的转染效率［7］。miR-30a表达水平的提高对乳腺癌细胞的生物功能产生一系列影响，Cells+UTMD+miR-30a组乳腺癌细胞凋亡水平上调，凋亡相关蛋白cl-caspase-3水平降低，癌基因Bcl-2蛋白和增殖相关蛋白Ki-67表达降低。研究证实，经UTMD递送后，癌细胞内上调的miR-30a对乳腺癌细胞下游凋亡和增殖通路具有一定的影响。一项慢性髓系白血病细胞株的研究显示，miR-30a高表达可促进K562细胞的凋亡［8］。综前所述，miR-30a可能具有促进癌细胞凋亡的作用。本研究通过软件预测发现，miR-30a可能同Slug 3'-UTR结合，经荧光素酶报告基因实验证实，miR-30a直接结合于Slug 3'-UTR，并且UTMD递送的miR-30a造成Slug基因表达和蛋白表达降低，证实Slug是miR-30a的靶点。Transwell实验显示，UTMD递送的miR-30a减少了MDA-MB-231的侵袭能力。进一步检测EMT标志蛋白证实，Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平明显降低。在EMT进程中，癌细胞逐渐丢失上皮表型，缺乏细胞-细胞间的粘附性，增强间充质特性，表现为更强的游离性，是癌细胞转移的重要机制。主要的EMT标志物包括上皮标记物（如E-cadherin）以及间充质标志物（如Vimentin、N-cadherin）［9］。Snail的过度表达是EMT发生的先决条件，而Slug属于Snail家族，在肿瘤进展过程中亦会触发EMT［10-11］。Slug抑制后可增加紧密连接蛋白CLDN表达，减少癌细胞的侵袭和转移性，发挥调节乳腺癌EMT的作用［12］。Slug还可以通过转录作用激活三叶虫FSCN基因表达，而FSCN在细胞内发挥维持丝状伪足的作用，推测miR-30a抑制的Slug下调了MDA-MB-231细胞丝状伪足的组装，造成Vimentin和N-cadherin水平降低［13］。本研究结果证实，UTMD有效的递送miR-30a进入MDA-MB-231细胞，并下调了癌细胞的EMT水平和细胞侵袭能力。

综上，UTMD是一种有效的miRNA递送方法，miR-30a对乳腺癌细胞EMT具有靶向抑制作用，UTMD可以通过递送抑癌基因成为一种基因治疗方法。