Holliday交叉识别蛋白表达与胃癌发生发展及其预后的关系

王立 谢鹏 贺小武 季世伟 周建平

中国是胃癌高发区［1］，>60%的胃癌患者在初诊时已处于进展期，预后较差［2］。为改善胃癌预后，现丞需寻找新的分子生物学标志物，Holliday交叉识别蛋白（HJURP）位于人染色体的2q37.1上，长约17.73kb，有9个外显子、2529个核苷酸，编码748个氨基酸［3］，是着丝粒蛋白A的分子伴侣（CENP-A），与CENP-A结合促进CENP-A在核小体上的招募，辅助核小体装配，若其功能不全，可能会导致肿瘤发生［4］。已有研究报道，HJURP在乳腺癌、肝癌中呈现高表达，且与不良预后相关［5-6］，但HJURP在胃腺癌中的高表达与预后并不相关［7］。本研究拟通过检测HJURP在胃癌及正常胃组织中的表达，分析其与临床病理及预后的相关性，探讨HJURP基因与胃癌之间可能存在的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2009年1月至2016年12月本院普外科收治的胃癌患者79例，胃癌根治术前均未接受放、化疗等治疗。其中，男58例，女21例；年龄36～83岁，中位年龄66岁；肿瘤直径≥5 cm者26例，肿瘤直径<5 cm者53例（若肿块为溃疡型，以溃疡最外侧缘为界确定肿瘤直径）；病理组织学类型，中高分化癌51例、低分化或未分化癌28例；胃壁浸润程度即胃壁侵犯深度，T1/T2 17例、T3/T4 62例；有淋巴结转移58例，无淋巴结转移21例；TNM分期参照2018年美国癌症联合委员会标准，Ⅰ/Ⅱ期30例、Ⅲ/Ⅳ期49例；术后病理证实脉管有癌栓者43例，无癌栓者36例；术前CEA≥5 ng/mL者63例，<5 ng/mL者16例；术后电话或门诊随访，死亡44例，中位生存期39个月。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法 收集79例胃癌患者的胃癌组织作为实验样本，另随机选取同期于本院就诊的胃良性疾病患者27例，收集其正常胃组织（非癌样本旁的正常胃组织）作为对照样本。采用免疫组化二步法检测正常胃部组织、胃癌组织中HJURP蛋白的表达。病理蜡块连续切片，厚度3～5 μm，3片；将切片放入60 ℃烤箱烘烤2 h；二甲苯浸泡2次，进行脱蜡，每次5 min；无水乙醇2次、95%乙醇1次、70%乙醇1次，进行水化，每次3 min；然后，纯水漂洗3 min，95 ℃预热，0.01 M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）抗原修复20 min，加入3%过氧化氢甲醇溶液静置10 min进行阻断，加入5%BSA封闭液室温静置20 min封闭，滴加HJURP一抗（1∶200）4 ℃过夜，滴加辣根酶标记的兔二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染后封片。实验中使用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照，HJURP一抗和辣根酶标记兔二抗均购自AbCAM 公司。病理读片、判断分别由一位病理科主任医师和一位病理科副主任医师独立完成。

1.3 观察指标 HJURP在胃癌组织中的表达情况，病理判读评分：染色范围未着色为0分，<25%为1分，25%～75%为2分，>75%为3分；染色强度评分范围为0～3分；以染色强度评分与染色范围评分的乘积作为最终评分，并据此将实验样本分为阴性组（0～2分）和阳性组（3～9分）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验或Fisher精准；生存曲线采用Kaplan-Meier方法评估，并用log-rank检验比较差异；构建单因素、多因素的Cox比例风险回归模型预测生存期。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HJURP在胃癌及正常胃组织中的表达 HJURP主要表达于细胞质中，见图1。实验样本中阳性表达33例（41.8%），正常胃组织中阳性表达5例（18.5%），差异有统计学意义（P=0.037）。

图1 HJURP在胃癌及正常胃组织中的表达（免疫组化染色）

2.2 HJURP表达阳性组与阴性组的临床病理资料比较 HJURP的表达水平与胃癌组织的淋巴转移、TNM分期、脉管有无癌栓有相关（P<0.05），而与性别、年龄、术前CEA、肿瘤大小、分化程度、胃壁侵润深度无关（P>0.05）。见表1。

表1 HJURP表达阳性组与阴性组的临床病理资料比较

2.3 生存分析 79例胃癌患者的总体中位生存时间为56个月（95%CI：31.856-80.144），其中HJURP高表达患者的中位生存时间为36个月（95%CI：23.313-48.687），显著低于HJURP低表达患者，log-rank检验显示差异有统计学意义（P=0.005）。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线图，见图2。单因素Cox风险回归分析，肿瘤的胃壁浸润深度、淋巴转移及TMN分期、HJURP表达与生存期相关，可能是胃癌的临床预后因子。进一步校正，纳入单因素回归分析中P<0.05的因素进行多因素Cox回归，结果提示HJURP表达水平与肿瘤TNM分期等因素可以作为胃癌的预后因子预测患者的OS。见表2。

图2 HJURP表达对胃癌患者生存期影响的Kaplan-Meier曲线

表2 影响胃癌患者预后的单因素、多因素Cox回归分析

3 讨论

流行病学证据显示，环境、饮食等因素在胃癌的发生过程中起重要作用［8］。胃癌发病在世界范围内存在较大的地理、人群分布差异，中国、日本、韩国为代表的东亚地区发病率及死亡率明显高于北美、欧洲及非洲地区［9］。与发病率同样高的日本、韩国相比，中国胃癌患者的5年相对生存率较低，可能是由于我国大多数胃癌患者在发现时已处于晚期，而胃癌的治疗效果与首次诊断时间密切相关［10］。因此，积极发现新的分子生物学标记物，有助于提高胃癌的早期诊断率，协助临床诊疗，延长我国胃癌患者的生存期。

HJURP于2007年由TATSUYA K等发现，是毛细血管扩增性共济失调突变（ATM）通路的下游靶基因，DNA双链断裂（DBS）可以引起HJURP的表达增加，DNA损伤后HJURP参与DSB损伤修复过程中的同源重组，而DNA修复途径中的重要成分表达异常往往会增加基因突变和肿瘤发生的机会。当HJURP表达被抑制，细胞内会出现异常的染色体融合，引起基因的不稳定性，因此认为HJURP是维持染色体稳定的一个不可或缺的因素［5］。FOLTZ等［11］研究发现在着丝粒染色质装配过程中，HJURP是CENP-A的特异性分子伴侣。CENP-A是组蛋白H3的变异体，维持着丝粒定位并影响着丝粒的形成，对高保真染色体分离至关重要，而着丝粒的功能异常可导致染色体的异常分离，进而诱发肿瘤的发生［12-13］。近年来，HJURP表达与恶性肿瘤的相关研究陆续出现，众多研究提示HJURP表达异常可能与肿瘤的发生与预后相关。KATO等［5］发现HJURP通过参与DSB过程，参与维持染色体的稳定及细胞永生，并观察到HJURP表达异常与肺癌的不良预后相关。HU等［3］发现HJURP在肝细胞肝癌（HCC）组织中的表达明显高于正常组织，且其高表达是HCC患者预后的独立危险因素。迟铖［7］研究发现，HJURP在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，此种差异性表达与总体生存率无差别，但在未出现远处转移的胃腺癌患者中，HJURP高表达的胃腺癌患者总生存期明显高于HJURP低表达的胃腺癌患者。

本研究对胃癌组织和正常胃组织的病理切片进行免疫组化染色，探讨HJURP与胃癌的关系，发现胃癌组织中HJURP的表达明显高于正常胃组织，进一步结合实验样本的临床病理特征进行分析，结果提示HJURP的表达可能与胃癌组织的淋巴转移、TNM分期、脉管有无癌栓相关，而与性别、年龄、术前CEA、肿瘤大小、分化程度、胃壁侵润深度无关。生存分析发现，胃癌组织中HJURP基因的高表达往往与患者的不良预后相关，提示HJURP表达可能是胃癌患者预后不良的独立预测因子，这与HU等［3，5］研究HJURP在肝癌等肿瘤中的表达结果一致，但与迟铖［7］研究HJURP在胃腺癌中的表达结果相悖，此种差异是否与入组患者的疾病分期、病理分型等不同因素相关，仍有待进一步深入研究。

综上，HJURP未来可能会成为预测胃癌患者预后的一个重要指标，可通过检测胃癌患者的HJURP表达，积极协助临床诊疗以获得更好的预后，甚至基于此分子基因靶点进行胃癌靶向治疗相关分子通路及药物的探索，为胃癌的治疗提供新思路。