谷子抗咪唑啉酮的遗传应用和基因初定位

宋 慧，王 涛，田礼新，张 扬，李 龙，邢 璐，刘金荣，冯佰利

（1安阳市农业科学院谷子研究所/河南省谷子育种工程技术研究中心，河南安阳455000；2安阳工学院生物与食品学院，河南安阳455000；3西北农林科技大学农学院，陕西杨凌712100）

0 引言

谷子具有节水抗旱、耐贫瘠、耐储藏的特点，是C3模式作物，对中国农耕文化发展和现代农业科技有着重要作用[1-2]。近年来，随着国家现代农业产业技术体系持续支持，科研单位联合攻关，在抗除草剂品种培育、精播免间苗、全程机械化管理、品质提升、产业链延伸等领域取得突破性进展，谷子的种植方式也由单户向产业化、规模化方向发展[3-6]。以河南省为例，2010—2018年，谷子种植面积由3.52万hm2增长到4.89万hm2，增幅达到34.4%，单产增加25.73%（数据来源于河南省种子管理站）；受谷子经济效益的影响，全省谷子种植面积总体上呈稳中上升趋势。但是，在雨热同季的华北夏谷区，谷田杂草种类繁多，尤其谷田单子叶恶性杂草，苗期长相与谷苗相似，不易区别，不易剔除，往往造成减产20%～30%，严重制约谷子产业的发展[7-9]。

化学除草是谷田除草的主要方式和发展方向，目前谷子推广的品种多为抗拿捕净品种，需要2种除草剂配合使用才能彻底除草。咪唑啉酮类除草剂独具兼杀单双子叶杂草的优势，可防除众多的一年生和多年生禾本科杂草以及阔叶杂草、莎草科杂草等[10-11]。药物通过根、茎、叶处理后，经由植株木质部和韧皮部传导，作用于植物分生组织，产生抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支链氨基酸，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，破坏蛋白质的合成，干扰DNA合成及细胞的分裂与生长，引起植株死亡[12-14]。抗性品种的选育有效地解决了田间谷子见苗和除草问题，降低劳动强度，节约劳动成本，推进了谷子轻简化生产技术进程[15]。本研究团队从河北省农林科学院谷子所引进抗咪唑啉酮除草剂的突变材料，经自交和回交得到一批抗咪唑啉酮类除草剂的育种材料。此材料对于抗咪唑啉酮类除草剂谷子品种的培育及谷子杂交种新型制种体系的构建都具有十分重要的意义。然而，关于谷子对咪唑啉酮抗性的来源和遗传尚不清楚。本研究以抗性谷子品系‘安5158’和敏感性谷子品种‘豫谷9号’为试验材料，通过抗性鉴定和抗性生理机制研究，分析谷子对除草剂产生敏感性的遗传基础，并对此敏感性基因进行初定位，旨在为开展谷子抗除草剂分子标记辅助选择育种和转基因育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

材料来源于安阳市农业科学院谷子研究所资源库。抗咪唑啉酮谷子新品系‘安5158’由安阳市农业科学院谷子所利用常规有性杂交和回交方法将青狗尾草的抗咪唑啉酮基因转移至栽培谷子中，创制出了抗咪唑啉酮谷子新种质，经过系统选育而成，各项性状稳定。敏感型亲本‘豫谷9号’植株经济性状和抗性性状纯合一致。咪唑啉酮类除草剂为德国巴斯夫公司生产的甲咪唑烟酸水剂。

1.2 试验点自然概况

田间试验在河南省北关区柏庄镇安阳市农业科学院试验基地进行，该区域位于太行山东南麓，黄河以北，114°37′E、36°18′N，属暖温带气候，海拔75 m，年平均气温13.6℃，年平均降水量606.1 mm，无霜期201天。供试土壤为黄壤土，土壤肥力中等，呈弱碱性(pH 7.64)，耕层土壤含有机质1.31%、全氮0.85 g/kg、有效氮54.6 μg/g、速效磷20.4 μg/g、速效钾212 μg/g。

1.3 试验设计

1.3.1 谷子萌发试验 试验于2017年5月在安阳市农业科学院实验室进行。谷子种子发芽前用去离子水浮选去除瘪粒，精选饱满、大小一致的种子，用2%的双氧水消毒10 min。在铺有滤纸的培养皿（直径15 cm）中，分别加入不同浓度(0、150、200、250、300、350、400、450、500 mL/hm2)的甲咪唑烟酸药液，每个培养皿均匀摆放100粒抗性和敏感性的种子，每个处理3次重复，用双层滤纸覆盖，置于28℃的恒温培养箱内（浙江拓普智能人工气候箱RTOP-268D）培养，待发芽至第7天，统计不同处理的发芽情况，第15天调查种子存活粒数，计算存活率。

1.3.2 抗性效应试验 试验于2017年在安阳市农业科学院柏庄综合试验站进行。6月20日播种，待3叶1心期，喷施不同浓度甲咪唑烟酸进行抗性效应试验。小区行长3 m，行距0.4 m，每小区6行；设置6个处理，用药量分别为0、150、250、350、450、500 mL/hm2，以不抗咪唑啉酮类除草剂的品种‘豫谷9号’为对照，均匀喷洒至叶面。喷药1、4、7天分别取样，每个小区取6株倒二叶叶片，测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)生理指标。

1.3.3 咪唑啉酮抗性的遗传试验 2016年夏季将抗性材料‘安5158’和敏感材料‘豫谷9号’进行有性杂交，2016年在海南试验基地鉴定F1和亲本的抗性表现。2017年在夏季柏庄基地将F1与母本‘豫谷9号’进行回交获得BC1群体，2018年夏季在柏庄基地鉴定BC1分离世代的抗性表现，统计分离比例，进行卡方测验。亲本及各遗传世代在谷子3～5叶期用德国巴斯夫公司生产的甲咪唑烟酸水剂，处理浓度为250 mL/hm2，5天不抗除草剂材料开始出现表型，15天后调查成活苗与死苗数。

1.4 生理指标的测定

取谷子倒二叶叶片，测定叶片的生理生化指标。采用SOD试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供）测定SOD活性；采用POD试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供）测定POD的活性；采用CAT试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供）测定CAT的活性；采用BCA试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供）测定MDA浓度。

1.5 数据统计与处理

数据采用SPSS v19.0进行显著性分析，采用LSD方法进行多重比较(P＜0.05)，采用Origin 8进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度甲咪唑烟酸对谷子种子萌发的影响

由表1可知，用不同浓度的甲咪唑烟酸喷施抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9号’种子，发芽率和存活率受抑制程度不同。抗性材料‘安5158’处理浓度为450 mL/hm2时，发芽率受显著抑制，存活率为14%，处理浓度为500 mL/hm2时，发芽率7%，没有存活的植株。在150 mL/hm2浓度下，敏感材料‘豫谷9号’发芽率和存活率大幅度降低；浓度为250 mL/hm2时，种子发芽后完全不能存活。由此可知，咪唑啉酮除草剂对谷子种子的萌发有一定的抑制作用，但抗性材料的种子发芽率和发芽后存活率受抑制作用影响较小。

2.2 不同浓度咪唑啉酮对谷子叶片生理指标的影响

由图1中可知，喷施甲咪唑烟酸后，随着喷药时间的延长及甲咪唑烟酸处理浓度的逐渐增加，抗性和敏感性材料的SOD活性均呈下降趋势。敏感性材料‘豫谷9号’，喷药后1天SOD活性下降幅度较小，与对照处理相比无显著差异；喷药后4天和7天SOD活性大幅下降，与对照差异显著，尤其喷施第7天在250 mL/hm2浓度下SOD活性的下降幅度最大。抗性材料‘安5158’，随着喷药处理时间延长，SOD活性呈逐渐降低，以450 mL/hm2浓度下SOD活性下降明显。结果表明，抗性材料的SOD活性比较稳定，敏感性材料的SOD活性更易受除草剂影响。

图1 不同浓度咪唑啉酮对谷子叶片SOD活性的影响

由图2可知，喷施甲咪唑烟酸后，随着喷药时间的延长及甲咪唑烟酸处理浓度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9号’的POD活性均呈下降趋势，敏感性材料的POD活性下降幅度更为明显。喷施甲咪唑烟酸后1天，抗性和敏感性材料的POD活性与对照相比均无显著差异。喷药后4天，敏感性材料‘豫谷9号’在250 mL/hm2浓度下POD活性与对照处理呈显著差异；而抗性材料‘安5158’喷药第7天在350 mL/hm2浓度下POD活性开始下降，450 mL/hm2浓度下POD活性急剧下降，与对照相比达到显著水平。

图2 不同浓度咪唑啉酮对谷子叶片POD活性的影响

由图3可知，喷施甲咪唑烟酸后，随着喷药时间的延长及甲咪唑烟酸处理浓度的增加，抗性和敏感性材料的CAT活性均呈下降趋势。喷药后1天，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9号’的CAT活性与对照相比均无显著差异。喷药后4天，抗性材料‘安5158’在250 mL/hm2浓度下CAT活性与对照相比下降了11.4%，达差异显著水平，在250～350 mL/hm2浓度下CAT活性下降水平分别为40%和76.3%。喷药后7天，敏感性材料‘豫谷9号’分别在450 mL/hm2和500 mL/hm2浓度下CAT活性与对照处理呈显著差异(P＜0.05)。

图3 不同浓度咪唑啉酮对谷子叶片CAT活性的影响

结果表明，抗性材料‘安5158’的CAT活性降低幅度明显小于敏感性材料‘豫谷9号’，说明抗性材料‘安5158’CAT活性更为稳定，化解甲咪唑烟酸胁迫的能力更强。

从图4可看出，随着甲咪唑烟酸处理浓度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9号’的MDA活性均呈上升趋势。且对于抗性材料‘安5158’，喷药第7天的450 mL/hm2的MDA活性急剧上升，与对照之间差异显著，而敏感材料‘豫谷9号’在第4天和第7天的250 mL/hm2MDA活性远远高于第1天，尤其是随着处理浓度的增加，升高幅度也急剧增大。说明敏感材料‘豫谷9号’的MDA活性对除草剂处理更加敏感。

图4 不同浓度咪唑啉酮对谷子叶片MDA活性的影响

2.3 谷子抗性遗传基础鉴定

在对抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9号’喷施咪唑啉酮除草剂15天后，观察材料抗性效果反应。结果显示，抗性材料‘安5158’无药害反应，敏感材料‘豫谷9号’5天左右表现出谷子幼苗心叶开始发黄，然后整株变黄，最后干枯死亡，BC1群体表现出50%左右的死亡率（图5），经卡方检验，符合回交群体1:1的孟德尔遗传比例，验证了前人属于单基因遗传的结论（表2）。

表2 抗性和敏感材料喷施甲咪唑烟酸后的调查结果

图5 抗性和敏感亲本及BC1群体喷施甲咪唑烟酸后15天的生长状态

2.4 谷子抗咪唑啉酮敏感性基因初定位

通过构建F2:3家系抗、感池，及喷施除草剂前、喷施除草剂后的混池，进行BSR-Seq分析，共得到79521个关联SNP，其中位于谷子1号染色体上的SNP有929个，占比15.06%，喷施除草剂前抗、感池中共得到930个关联SNP，其中位于谷子1号染色体上的SNP有537个，占比57.74%，喷施除草剂后抗、感池中共得到1243个关联SNP，其中位于谷子1号染色体上的SNP有640个，占比51.49%（图6）。可知，与甲醚烟酸抗性相关的SNP位点富集在1号染色体短臂上。结合滑动窗口法将对甲咪唑烟酸敏感性基因初步定位在第1染色体短臂上6.8～30.8 Mb之间，区间大小为24 Mb（图7）。通过对差异表达基因做进一步分析，发现喷施除草剂前后共鉴定出132个差异表达基因，其中有9个基因位于初定位区间内。

图6 咪唑啉酮抗性基因相关的SNPs位点在染色体上的分布

图7 利用BSR-seq分析谷子与甲醚烟酸抗性相关基因的定位

3 讨论

农作物能够进行正常生长发育的前提要素是保证种子可以萌发，萌发期也是对外界环境的变化最为敏感的生育时期。除草剂的不规范使用剂量可以造成除草剂在土壤中的残留，对种子的萌发会产生严重的影响。王倩等[16]对241份甘蓝型油菜种子进行25 mg/kg苯磺隆处理，综合分析得出，25 mg/kg苯磺隆处理后，油菜种子的发芽势和发芽率较对照处理分别降低6.81%和5.37%，对种子萌发产生了抑制作用。本研究从谷子种子萌发和幼苗生长的角度对谷子抗性和敏感品种进行抗性鉴定。结果表明，不同浓度的除草剂处理对抗性和敏感性谷子发芽率、存活率和株高的抑制程度明显不同。抗性材料在安全剂量(250～450 mL/hm2)范围内，各种鉴定指标基本正常；随除草剂浓度的增加，抗性材料受药害程度明显加重，当除草剂浓度超过450 mL/hm2时，对抗性材料产生致死性的伤害。敏感性材料对除草剂的反应更为敏感，低剂量(＞150 mL/hm2)的除草剂就可对其造成致死性的损伤，本研究与韩玉军等[17]研究发现的不同浓度乙草胺对玉米种子萌发产生抑制作用的结论相似。

对于农作物而言，喷施除草剂也是一种逆境胁迫，这种非生物胁迫可以达到防控杂草的目的，同时也会导致作物体内抗氧化系统发生相应的应激响应。张丽光等[18]研究发现，在喷施除草剂苄嘧磺隆的初期，随着苄嘧磺隆浓度的逐渐增加，谷子幼苗叶片中MDA含量呈逐渐增加趋势，且喷施除草剂初期，谷子叶片中MDA含量的变化趋势较后期更明显。徐田军等[19]对玉米喷施2种除草剂的研究结果也发现，随着2,4-D-丁酯和烟嘧磺隆浓度的增加，4个玉米叶片中SOD和CAT活性呈降低趋势，而MDA含量呈增加趋势。本研究结果表明，叶片喷施不同浓度除草剂后，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9号’谷子叶片中保护性酶（CAT、SOD和POD）活性均不同程度下降，而MDA含量则显著升高，表明喷施除草剂的浓度过高会导致谷子叶片中活性氧物质的大量积累，进而导致叶片中保护酶活性下降。同时，2种不同抗性材料比较，抗性材料的各个生理指标的变化趋势平稳，而敏感性谷子叶片中活性氧代谢指标变化趋势明显，表明抗性材料对除草剂具有较强抗性。

本试验所使用的咪唑啉酮类除草剂（甲咪唑烟酸）有效成分浓度为240 g/L（水剂），实际田间抗性效应鉴定剂量为250 mL/hm2，与李小童等[20]研究抗咪唑啉酮油菜对选择性除草剂的抗性效应的最低有效剂量一致。在对抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9号’喷施咪唑啉酮除草剂15天后，观察材料抗性效果反应。结果显示，选育出的抗性材料‘安5158’无药害反应，对照亲本表现出谷子5天左右幼苗心叶开始发黄，然后逐渐变黄，最后整株死亡。拟南芥的ALS酶中与苯磺隆和咪唑啉酮除草剂结合部位的结构研究显示，苯磺隆和咪唑啉酮都是通过阻断ALS底物通道方式抑制ALS活性的[21-22]。

通过抗性和敏感性谷子材料表型进行鉴定，表明其正反交F1代对除草剂敏感性表现一致，认为该敏感性基因属于细胞核遗传；对群体进行敏感性鉴定，结果出现抗:敏感分离比例为1:1，符合孟德尔遗传，说明该敏感性基因受单个隐性基因控制。利用常规的杂交和回交等育种手段，可以很方便地将抗咪唑啉酮除草剂基因转移到其他油菜品系，培育抗咪唑啉酮除草剂的新品种。而且，用抗咪唑啉酮品种做父本配制杂交种，F1仍表现出咪唑啉酮抗性，杂交种施用除草剂1次即可去除假杂种和杂草，获得整齐一致的杂种群体，有利于杂种纯度鉴定和提高杂种的产量与品质。

采用第二代测序平台进行RNA-Seq高通量测序，通过收集、比对与分析在除草剂茎叶处理条件对谷子叶片中的转录本数据，高通量的分离和筛选差异表达基因，将该除草剂抗性基因定位于谷子第1染色体短臂6.8～30.8 Mb区间内，该区间有9个基因差异表达，初步推定为抗咪唑啉酮的候选基因，为抗咪唑啉酮基因的精细定位提供参考。

4 结论

随着甲咪唑烟酸浓度的逐渐增加，抗性和敏感型谷子材料的发芽率和存活率均呈显著下降趋势，且敏感型谷子种子萌发的致死浓度要低于抗性谷子材料。同时，抗性材料在安全剂量(250～450 mL/hm2)范围内，各种鉴定指标基本正常；随除草剂浓度的增加，抗性材料受药害程度明显加重，当除草剂浓度超过450 mL/hm2时，对抗性材料产生致死性的伤害。敏感性材料对除草剂的反应更为敏感，低剂量(＞150 mL/hm2)的除草剂就可对其造成致死性的损伤，通过群体敏感性鉴定得知，敏感性基因受隐性基因控制，且将抗性基因初步定位在谷子的第1号染色体短臂6.8～30.8 Mb区间内，该区间有9个基因差异表达，推断为候选基因。