外周血miR-21、miR-155与自身免疫性肝病患者Th17/Treg的相关性研究

魏毅强 张志强 杨亚莉

（新乡市第一人民医院消化内科，河南 新乡 453000）

自身免疫性肝病起病初期多表现为嗜睡、乏力等轻微症状，部分患者可无自觉症状，患者极易忽视而延误治疗，逐渐发展为发热、腹水及黄疸等，严重可继发肝衰竭、肝癌等危及生命，故寻求特异性、相关性指标，尽早诊断、治疗十分必要。研究表明，乙型肝炎不同阶段患者体内辅助性T 淋巴细胞17（Helper T cell 17，Th17）和调节性T 淋巴细胞（Regulatory T cell，Treg）的平衡水平表现为不同程度的失衡状态[1]，与自身免疫性疾病及肝脏疾病发生与发展有关，临床可对其检测作为疾病活动度及病情的评价指标。微小RNA 为一种有调控能力，可在细胞内稳定存在的非编码短链RNA，各类疾病的进展中均可发现相应的微小RNA 参与。例如，溃疡性结肠炎患者体内出现微小RNA-155（MicroRNA-155，miR-155）表达上调，且与炎症因子及Th17 的异常表达有关[2]；微小RNA-21（MicroRNA-21，miR-21）与自身免疫性疾病系统性红斑狼疮密切相关[3]。这两种微小RNA 均表现出对自身免疫性疾病的高敏感性，然而临床对于自身免疫性肝病患者疾病微小RNA 表达和其与患者Th17／Treg 表达失衡间的关系鲜有研究，故本研究试探讨自身免疫性肝病患者miR-21、miR-155 表达水平与Th17/Treg表达平衡间的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月至2019 年1 月我院收治的65 例自身免疫性肝病患者作为观察组，其中男性27 例，女性38 例；年龄37～60 岁，平均年龄48.46±4.75 岁；体质量指数（Body mass index，BMI）19.39-24.41 kg·m-2，平均BMI（20.35±3.43）kg·m-2；同时期选取我院65 例健康体检者为对照组，其中男性30 例，女性35 例；年龄35～60 岁，平均年龄48.55±4.68 岁；BMI 19.40-24.62 kg·m-2，平均BMI（20.51±3.52）kg·m-2，两组间差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。

纳入标准：观察组患者均符合自身免疫性肝病的诊断标准[4]，两组入组前未接受保肝等有相关治疗；未合并严重精神或认知疾病；经医院伦理委员会批准；患者及其家属均知情同意。排除标准：排除合并其他肝脏疾病者，合并肝肾功能不全、肝脏恶性肿瘤者，近期有免疫调节或抗病毒药物服用史患者等。

1.2 检测仪器

荧光定量PCR 检测仪（型号：BTK-96，无锡百泰克生物科技有限公司）；实时荧光定量试剂盒（货号：TL988，西安天隆科技有限公司）。流式细胞仪（型号：伯乐ZE5，伯乐生命医学产品（上海）有限公司），总RNA 提取试剂盒（货号：6998452，Norgen Biotek 公司），反转录试剂盒（货号：ALH266-DWM，北京百奥莱博科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分离血清

两组患者均于入组后次日晨起（8:00 左右）空腹状态下，采集外周静脉血5 mL，以3000 r·min-1的速度离心20 min 后取血清备用。

1.3.2 荧光定量PCR 测定miR-21 与miR-155 水平

提取总RNA，采用的反转录试剂盒反转录后获得相应cDNA 模板，使用qRT-PCR 仪对其进行实时荧光定量PCR 检测。反应体系共20 μL，包含：2 μL cDNA 模板，10 μL SYBRR Mix Taq ll，0.4 μL ROX，下游及上有引物各0.8 μL，无菌双蒸水6 μL；反应步骤：95 ℃，33 s，1 循环；95 ℃，5 s；62 ℃，35 s，40 循环，各样本均重复进行3次，后以2-△△CT 法进行miR-155 和miR-21 表达水平的计算。引物序列，miR-155（片段长度76 bp）下游引物：5'-GCGACCTGTGAATTATCGAC-3'，上游引物：5'-TGCGTGCTACTGAGACCTAC-3'，miR-21（片段长度73 bp）下游引物：5'-GCTGACAATCGTTGGTACGT-3'，上游引物：5'-AAAGATGTTCGGTCATCGAT-3'。

1.3.3 流式细胞仪测定外周血T 细胞水平

采用流式细胞仪测定外周血辅助性T 细胞（Th17）以及调节性T 细胞（Treg），以CD4+IL-17 在CD4+T 细胞中百分比来表示Th17 水平，以CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T 细胞中百分比来表示Treg 细胞水平，计算Th17/Treg 的比值。

1.3.4 外周血Th17/Treg 和miR-155 及miR-21 间相关性

Th17/Treg 作为因变量，miR-155、miR-21 外周血水平作自变量，行多元线性回归分析，评估其间相关性。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS26.0 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用独立样本t进行检验；计数资料以例或率（n（%））表示，采用χ2进行检验；相关性分析采用多元线性分析法；P＜0.05 提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血miR-21 以及miR-155 水平比较

观察组患者miR-21 以及miR-155 水平明显高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 外周血miR-21 及miR-155 比较（，n=65）

表1 外周血miR-21 及miR-155 比较（，n=65）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

2.2 两组外周血Th17 及Treg 细胞水平比较

观察组Treg、Th17 外周血含量及Th17/Treg水平均较对照组显著增加，差异显著（P＜0.05），见表2 和图1。

表2 Treg、Th17 及其平衡水平比较（，n=65）

表2 Treg、Th17 及其平衡水平比较（，n=65）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

图1 Th17 及Treg 流式细胞检测图（Q2 为相应细胞所在区）

2.3 外周血Treg、Th17 细胞平衡和miR-155 及miR-21 含量间相关性

以外周血Th17/Treg 为因变量，miR-155 及miR-21 含量为自变量行多元线性回归分析知，外周血miR-155 及miR-21 水平与Th17/Treg 比值呈正相关（rmiR-21=0.444，回归系数miR-21=0.015，tmiR-21=2.386，PmiR-21=0.019，rmiR-155=0.363，回归系数miR-155=0.018，tmiR-155=2.668，PmiR-21=0.009，均P＜0.05）。

3 讨论

自身免疫性肝炎患者体内存在免疫系统异常激活，其中活化的Treg 细胞合成、释放大量转化生长因子β1（Transforming growth factor，TGF-β 1）、白介素（Interleukin，IL）-10 等因子，Th17细胞则释放大量IL-23、IL-6 及IL-17 等炎性因子。其中TGF-β1 可对miR-21-5p 的表达进行调节，使机体大量产生miR-21，使后者对肝脏组织、细胞的凋亡及增殖过程调节加强，促进肝脏的损伤过程。而IL-23、IL-6 及IL-17 等表达上调，可反馈性的使炎症介导有关的miR-155 表达水平上升，miR-155 还可促进抗原呈递过程，对免疫过程相关因子释放产生调节，进一步影响其免疫过程。Th17/Treg 是反应机体Treg 细胞和Th17 细胞抑制炎症和促进炎症状态平衡的重要指标，有研究指出[5]：自身免疫性肝病患者外周血miR-155 水平和IL-6、IL-17 以及IL-10 含量呈正相关，miR-21 则与IL-23、IL-17 及IL-10 含量正相关，提示自身免疫性肝病患者miR-155 与miR-21 可通过破坏Th17/Treg 平衡调控相关炎症因子表达，进而促进疾病的发生与发展，故临床可通过炎症控制或免疫调控等方式对患者Th17/Treg 失衡以及miR-155 与miR-21 异常高表达进行纠正，最终达到疾病控制和预后改善效果。然而本研究对不同活动度、不同分类的自发性肝病患者间的差异未进行分析，后续需进一步、全面研究进行探讨。

综上，自身免疫性肝病患者体内存在miR-21、miR-155 的上调和Th17/Treg 细胞平衡的失调，且前两者与Th17/Treg 失衡水平密切正相关，临床可从此入手改善预后及病情。