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携HE4 的纳米相变卵巢癌造影剂在体内成像实验研究#

2021-10-13张劲宜方善钰周婧君

四川生理科学杂志 2021年7期
关键词:全氟聚乳酸微球

张劲宜 方善钰 周婧君

(1.萍乡市妇幼保健院妇产科,江西 萍乡 337300;2.重庆医科大学重庆 400010)

卵巢癌其发病率为妇科恶性肿瘤第三,死亡率却第一位[1]。但是本病I 期患者5 年生存率大于90%,而晚期仅为29%[2-3]。近年来,超声分子影像学已成为国际研究焦点。目前的超声纳米分子造影剂可通过单乳法和碳二亚胺法制备,再通过冷冻干燥法使粒径最小,而包裹全氟已烷(Perfluorohexan,PFH)的是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid-cooh,PLGACOOH)高分子材料,稳定性较高,在高强度聚焦超声(High intensity focused ultraso-und,HIFU)的辐照下,能使液相的PFH 造影剂转变成气相的超声纳米微泡分子造影剂,从而使超声增强显像[4]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)通过化学作用连接特异性配体,形成稳定的化学键[5-6]。

HE4(Human epididymis protein4,HE4)又被称作人附睾蛋白4[7]。有研究显示,HE4 在妇女的卵巢癌组织中表达较高,在其他正常与不正常组织、系统中找不到[8-10]。将HE4 偶联在纳米造影剂表面,通过靶向能够牢固地聚集在肿瘤细胞上并能从分子水平识别,从而液相变产生特异性增强显像。此外,通过一定功率的HIFU 辐照和超声波声压效应的作用,理论上能够使液体的全氟已烷(Perfluorohexan,PFH)变为气体,进而达到在超声上能增强显影效果。

基于以上认识,本研究先用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)、PFH、人附睾蛋白4-聚乙二醇-氨基(HE4-poly(Ethylene glycol)PEG-NH2)等通过单乳化法及碳二亚胺法,分散、溶解、离心制备得到人附睾蛋白4-全氟已烷-聚乳酸(HE4-PFHPLGA)纳米高分子造影剂,确定HE4 与普通全氟已烷-聚乳酸(PFH-PLGA)造影剂同样具有良好的链接性和稳定性后,在裸鼠体内验证了HE4-PFHPLGA 用作卵巢癌靶向超声造影剂的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

PLGA-COOH(深圳市魅罗科技有限公司)、PFH(美国Sigma 公司)、HE4-PEG-NH2(重庆川东化工有限公司化学试剂厂)、德国 Ependorf公司旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、DFY 型超声图像定量分析诊断仪(重庆医科大学超声影像实验室)

1.2 HE4-PFH-PLGA 冷冻纳米高分子造影剂的制备

用电子秤称取 100 mg PLGA 加入5 mL CH2CL2溶液中,用塑料薄膜封口,搅拌直至完全溶解;加入60 µL PFH,轻轻振荡10 s;将 20 mL 1.5% SC 溶液加入上述混合液中,高速分散均质机乳化5 min 后,置于冰箱中2 min;将烧杯放于旋转蒸发仪上用磁力搅拌器搅拌3 h,最大量使CH2CL2挥发;双蒸水洗涤3 次,离心收集微球;取5 mL 微球溶解在MES 缓冲液中;以EDC 与NHS 比为1:3,PLGA 与EDC 比为1:10 的比例先后加入微球溶液中,4 ℃振荡孵育30 min;用MES 洗涤混合液去除未反应的EDC 与NHS;称取10 mg HE4-PEG-NH2溶解在MES 缓冲液中并与上述所得PFH-PLGA 造影剂混匀,室温振荡孵化2 h,经双蒸水洗涤、离心,得到HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂。选取制备好的HE4-PFHPLGA 纳米高分子造影剂,置于冷冻干燥机中 3天,蒸发多余的水分,减少粒径长度,再冻存于冰箱中。称取5 mg 干燥之后的HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂,充分溶解在MES 缓冲液,冲洗离心直到浓度均为5 mg · mL-1HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂。

1.3 细胞培养及裸鼠接种分组

用含10%灭活小牛血清的McCoys5A 培养基培养OVCAR-3 细胞,置于37 ℃、5% CO2孵箱培养;每4 天传代一次,取对数生长期细胞种植在18 只雌性裸鼠身上,直到长出15 mm 的移植瘤。将所有移植瘤裸鼠随机分为3 组,每组6只,第1 组作为实验组,第2 组和第3 组作为对照组。

1.4 HE4-PFH-PLGA 体内靶向性增强成像

第1 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影剂 (浓度为5 mg · mL-1),6h后用HIFU 辐照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位观察造影剂显像;第2 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL 非靶向PFH-PLGA 造影剂(浓度为5 mg · mL-1),6 h 后用HIFU 辐照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位观察造影剂显像;第3 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影剂 (浓度均为5 mg · mL-1),6 h 后在卵巢癌移植瘤部位直接观察造影剂显影。观察HIFU 辐照前后卵巢癌移植瘤部位的造影显影以及HE4-PFH-PLGA 联合HIFU 成像对比。

1.5 统计学方法

所有数据应用SAS10.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用两独立样本t检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂的稳定性

完成HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂的制备后冷冻干燥保存。普通光学显微镜下,HE4-PFHPLGA 纳米高分子造影剂微球分布均匀,无团聚,单个微球的外观圆形;室温保存7 d 后,其外观仍完整,分布均匀,无团聚,见图1。

图1 HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂(×200 倍)

2.2 HE4-PFH-PLGA 体内靶向超声成像

把靶向造影剂和非靶向造影剂分3 组注入卵巢癌移植瘤部位6 h 后,观察到实验组HE4-PFHPLGA 靶向高分子造影剂在HIFU 辐照下使微球转变为微泡在超声下回声明显增强(P <0.05),见图2A、图2B;其余的两组对照组无明显变化,见图2C、图2D、图2E、图2F。

图2 HE4-PFH-PLGA 和PFH-PLGA 注入裸鼠在HFIU辐照前后图片

3 讨论

近年,超声造影剂分子成像技术迅猛发展[11]。包裹PFH 的是PLGA-COOH 高分子材料,稳定性较高,所以在本实验中HE4-PFH-PLGA,经过震荡,孵化都能保持一周以内的微球状态。且在HIFU 的辐照下,能使液相的PFH 造影剂转变成气相的超声纳米微泡分子造影剂[12-14]。氟碳液体的特性是可随着温度变化而变化,当外界温度到达58℃时氟碳液体可以转变为气体[15-16]。当造影剂进入裸鼠体内可以避免体温的影响从而达到造影效果。

本研究在卵巢癌移植瘤体内超声影像实验中,只有实验组HE4-PFH-PLGA 高分子造影剂通过HIFU 一定功率辐照后才能使超声显像造影回声增强,说明HE4-PFH-PLGA 在体内能有效靶向卵巢癌组织。这可能是因为偶联HE4 的HE4-PFHPLGA 高分子造影剂纳米微球能靶向卵巢癌移植瘤部位,并能有效聚集在肿瘤细胞表面。本研究中在卵巢癌移植瘤部位经过HIFU 辐照达到一定温度后纳米微球中的PFH发生液相变使超声造影成像。而PFH-PLGA 高分子造影剂虽经过HIFU辐照,但其未携带靶向标记物,不能到达肿瘤细胞表面聚集,不能有HIFU 滞留热效应而没有超声增强显像。

综上所述,本实验成功制备卵巢癌靶向HE4-PFH-PLGA 高分子造影剂,基本性质稳定,对卵巢癌移植瘤组织细胞具有明显靶向性,在体内经过HIFU 一定功率的辐照有良好的超声造影增强效果。为人们寻找更高效的靶向声学显像卵巢癌提供新方法。

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