携HE4 的纳米相变卵巢癌造影剂在体内成像实验研究#

张劲宜 方善钰 周婧君

（1.萍乡市妇幼保健院妇产科，江西 萍乡 337300；2.重庆医科大学重庆 400010）

卵巢癌其发病率为妇科恶性肿瘤第三，死亡率却第一位[1]。但是本病I 期患者5 年生存率大于90%，而晚期仅为29%[2-3]。近年来，超声分子影像学已成为国际研究焦点。目前的超声纳米分子造影剂可通过单乳法和碳二亚胺法制备，再通过冷冻干燥法使粒径最小，而包裹全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）的是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid-cooh，PLGACOOH)高分子材料，稳定性较高，在高强度聚焦超声(High intensity focused ultraso-und，HIFU)的辐照下，能使液相的PFH 造影剂转变成气相的超声纳米微泡分子造影剂，从而使超声增强显像[4]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH）通过化学作用连接特异性配体，形成稳定的化学键[5-6]。

HE4（Human epididymis protein4,HE4）又被称作人附睾蛋白4[7]。有研究显示，HE4 在妇女的卵巢癌组织中表达较高，在其他正常与不正常组织、系统中找不到[8-10]。将HE4 偶联在纳米造影剂表面，通过靶向能够牢固地聚集在肿瘤细胞上并能从分子水平识别，从而液相变产生特异性增强显像。此外，通过一定功率的HIFU 辐照和超声波声压效应的作用，理论上能够使液体的全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）变为气体，进而达到在超声上能增强显影效果。

基于以上认识，本研究先用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)、PFH、人附睾蛋白4-聚乙二醇-氨基（HE4-poly(Ethylene glycol)PEG-NH2）等通过单乳化法及碳二亚胺法，分散、溶解、离心制备得到人附睾蛋白4-全氟已烷-聚乳酸（HE4-PFHPLGA）纳米高分子造影剂，确定HE4 与普通全氟已烷-聚乳酸（PFH-PLGA）造影剂同样具有良好的链接性和稳定性后，在裸鼠体内验证了HE4-PFHPLGA 用作卵巢癌靶向超声造影剂的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

PLGA-COOH（深圳市魅罗科技有限公司）、PFH（美国Sigma 公司）、HE4-PEG-NH2（重庆川东化工有限公司化学试剂厂）、德国 Ependorf公司旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、DFY 型超声图像定量分析诊断仪（重庆医科大学超声影像实验室）

1.2 HE4-PFH-PLGA 冷冻纳米高分子造影剂的制备

用电子秤称取 100 mg PLGA 加入5 mL CH2CL2溶液中，用塑料薄膜封口，搅拌直至完全溶解；加入60 µL PFH，轻轻振荡10 s；将 20 mL 1.5% SC 溶液加入上述混合液中，高速分散均质机乳化5 min 后，置于冰箱中2 min；将烧杯放于旋转蒸发仪上用磁力搅拌器搅拌3 h，最大量使CH2CL2挥发；双蒸水洗涤3 次，离心收集微球；取5 mL 微球溶解在MES 缓冲液中；以EDC 与NHS 比为1:3，PLGA 与EDC 比为1:10 的比例先后加入微球溶液中，4 ℃振荡孵育30 min；用MES 洗涤混合液去除未反应的EDC 与NHS；称取10 mg HE4-PEG-NH2溶解在MES 缓冲液中并与上述所得PFH-PLGA 造影剂混匀，室温振荡孵化2 h，经双蒸水洗涤、离心，得到HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂。选取制备好的HE4-PFHPLGA 纳米高分子造影剂，置于冷冻干燥机中 3天，蒸发多余的水分，减少粒径长度，再冻存于冰箱中。称取5 mg 干燥之后的HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂，充分溶解在MES 缓冲液，冲洗离心直到浓度均为5 mg · mL-1HE4-PFH-PLGA纳米高分子造影剂。

1.3 细胞培养及裸鼠接种分组

用含10%灭活小牛血清的McCoys5A 培养基培养OVCAR-3 细胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱培养；每4 天传代一次，取对数生长期细胞种植在18 只雌性裸鼠身上，直到长出15 mm 的移植瘤。将所有移植瘤裸鼠随机分为3 组，每组6只，第1 组作为实验组，第2 组和第3 组作为对照组。

1.4 HE4-PFH-PLGA 体内靶向性增强成像

第1 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影剂 (浓度为5 mg · mL-1)，6h后用HIFU 辐照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位观察造影剂显像；第2 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL 非靶向PFH-PLGA 造影剂(浓度为5 mg · mL-1)，6 h 后用HIFU 辐照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位观察造影剂显像；第3 组移植瘤裸鼠通过尾静脉注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影剂 (浓度均为5 mg · mL-1)，6 h 后在卵巢癌移植瘤部位直接观察造影剂显影。观察HIFU 辐照前后卵巢癌移植瘤部位的造影显影以及HE4-PFH-PLGA 联合HIFU 成像对比。

1.5 统计学方法

所有数据应用SAS10.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用两独立样本t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂的稳定性

完成HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂的制备后冷冻干燥保存。普通光学显微镜下，HE4-PFHPLGA 纳米高分子造影剂微球分布均匀，无团聚，单个微球的外观圆形；室温保存7 d 后，其外观仍完整，分布均匀，无团聚，见图1。

图1 HE4-PFH-PLGA 纳米高分子造影剂（×200 倍）

2.2 HE4-PFH-PLGA 体内靶向超声成像

把靶向造影剂和非靶向造影剂分3 组注入卵巢癌移植瘤部位6 h 后，观察到实验组HE4-PFHPLGA 靶向高分子造影剂在HIFU 辐照下使微球转变为微泡在超声下回声明显增强（P ＜0.05），见图2A、图2B；其余的两组对照组无明显变化，见图2C、图2D、图2E、图2F。

图2 HE4-PFH-PLGA 和PFH-PLGA 注入裸鼠在HFIU辐照前后图片

3 讨论

近年，超声造影剂分子成像技术迅猛发展[11]。包裹PFH 的是PLGA-COOH 高分子材料，稳定性较高，所以在本实验中HE4-PFH-PLGA，经过震荡，孵化都能保持一周以内的微球状态。且在HIFU 的辐照下，能使液相的PFH 造影剂转变成气相的超声纳米微泡分子造影剂[12-14]。氟碳液体的特性是可随着温度变化而变化，当外界温度到达58℃时氟碳液体可以转变为气体[15-16]。当造影剂进入裸鼠体内可以避免体温的影响从而达到造影效果。

本研究在卵巢癌移植瘤体内超声影像实验中,只有实验组HE4-PFH-PLGA 高分子造影剂通过HIFU 一定功率辐照后才能使超声显像造影回声增强，说明HE4-PFH-PLGA 在体内能有效靶向卵巢癌组织。这可能是因为偶联HE4 的HE4-PFHPLGA 高分子造影剂纳米微球能靶向卵巢癌移植瘤部位，并能有效聚集在肿瘤细胞表面。本研究中在卵巢癌移植瘤部位经过HIFU 辐照达到一定温度后纳米微球中的PFH发生液相变使超声造影成像。而PFH-PLGA 高分子造影剂虽经过HIFU辐照，但其未携带靶向标记物，不能到达肿瘤细胞表面聚集，不能有HIFU 滞留热效应而没有超声增强显像。

综上所述，本实验成功制备卵巢癌靶向HE4-PFH-PLGA 高分子造影剂，基本性质稳定，对卵巢癌移植瘤组织细胞具有明显靶向性，在体内经过HIFU 一定功率的辐照有良好的超声造影增强效果。为人们寻找更高效的靶向声学显像卵巢癌提供新方法。