干预miR-31对哮喘小鼠肺组织TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信号通路的影响

李玲 李庆玲 刘文春

支气管哮喘（简称哮喘）是一种由嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等参与的异质性疾病，其主要特征为气道组织慢性炎症反应，患者主要临床表现为胸闷、咳嗽、反复喘息等，对患者身体健康、生活质量造成严重影响[1-3]。流行病学调查显示，儿童、老年人群为哮喘主要发病群体，近年来我国哮喘发病率一直居高不下，症状严重程度随时间变化而不断改变，多数患者清晨、夜晚时间症状较为严重[4]。研究发现，若哮喘症状不能及时根治，病情可能会不断发展而造成气道重塑[5]。因此，对哮喘进行及时有效的治疗具有重要意义。目前尚无一种特效的治疗哮喘的药物。研究发现，miR-31在哮喘症状中表达异常，其表达变化与炎症反应密切相关，与哮喘病情具有一定的相关性，miR-31对哮喘具有一定的诊断价值[6]。但关于调控miR-31表达对哮喘干预效果的研究还鲜有报道。本研究通过建立小鼠哮喘模型，探讨干预miR-31对哮喘小鼠肺组织转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/果蝇 MAD 基因 3 哺乳动物类似基因（drosophila mad gene 3 mammalian like gene，Smad3）、Toll样受体 2（toll-like receptor 2，TLR2）/髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD健康雄性小鼠40只，年龄7～10（8.5±1.2）周，体重 19～28（23.5±3.6）g，购自洛阳普万泰生物技术有限公司。在相对湿度50%～55%、温度（23.1±1.9）℃的环境中喂养1周，光照12 h/d。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 主要试剂和仪器 大鼠抗小鼠miR-31抗体（美国Invitrogen公司，批号：C1358）；兔抗小鼠 CD44抗体（美国BD公司，批号：N3667）；小鼠抗兔IFN-γ抗体（丹麦Dako公司，批号：D8569）；小鼠抗大鼠 IL-2、IL-4、IL-22、IL-3 抗体（美国 Selleck 公司，批号：S8753、S2357、S1675、S2565）；大鼠抗小鼠总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、一氧化氮（nitric oxide，NO）抗体（美国Hyclone 公司，批号：A25291、A23652）；小鼠抗兔 TGF-β1、Smad3抗体（美国Gibco公司，批号：A25291、A23652）；兔抗小鼠TLR2、MyD88抗体（丹麦Dako公司，批号：D9231、D8563）；小鼠抗大鼠 NF-κB p65抗体（美国 Sigma公司，批号：D9423）；卵白蛋白（上海泽叶生物科技有限公司，批号：ZY9000，规格：1 g）；硫酸铝钾（北京百奥莱博科技有限公司，规格：50 g，批号：Y16210）；miR-31激动剂（agomiR-31）、miR-31拮抗剂（antagomiR-31）（美国Hyclone公司，批号：A32265、A26719）；酶标分析仪（上海酶联生物科技有限公司，型号：ML-dr3518）。

1.3 建模及分组干预 随机选取10只小鼠作为正常组，不做任何处理。其余30只小鼠建立哮喘模型：将0.2 mg卵白蛋白、1 mg硫酸铝钾溶于2 ml 0.9%氯化钠注射液制作致敏液，分别于建模第1、7、14天腹腔注射0.2 ml致敏溶液；建模第15天起将小鼠置于3 L密闭玻璃箱，雾化吸入含有1%卵白蛋白的0.9%氯化钠溶液喷雾，隔日1次，0.5 h/次，持续干预1周。建模成功标准：打喷嚏、抓耳挠鼻，喘息，毛发无光，活动量减少。建模成功后，将30只小鼠分为哮喘组、上调组和下调组，每组各10只。上调组小鼠尾部静脉注射30 mg/kg agomiR-31干预，下调组小鼠尾部静脉注射30 mg/kg antagomiR-31干预，正常组、哮喘组小鼠尾部静脉注射等量0.9%氯化钠注射液（3 ml）干预，尾部静脉注射方法参照余涛等[7]研究中操作方法。

1.4 标本采集 干预结束后，取各组小鼠腹腔静脉血3 ml，采血过程参照伍磊等[8]研究中操作方法，2 000 r/min离心15 min后分离上清液，-40℃保存待检。各组小鼠麻醉后颈椎脱臼法处死，取小鼠肺组织保存待检。

1.5 各组小鼠肺组织病理学检查 采用HE染色。将小鼠肺组织完全浸泡在4%甲醛中，1 d后行常规石蜡包埋、4 μm连续切片。将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入70%、75%、80%、90%、95%浓度的乙醇溶液中各复水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸乙醇分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用95%乙醇进行脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜观察各组小鼠肺组织病理学改变情况。

1.6 各组小鼠肺组织miR-31、CD44 mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。将TRIzol试剂添加至各组肺组织标本中静置溶解，添加三氯甲烷600 μl搅拌，呈乳白色后离心处理提取总RNA，检测完整性之后合成cDNA，逆转录处理，使用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，2-ΔΔCt方法计算 miR-31、CD44 mRNA 表达量，内参为U6。U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。miR-31上游引物：5'-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGUC-3'，下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAT-3'。CD44 上游引物：5'-ACCAAGAAGACATCGATGCC-3'，下游引物：5'-TGTCCAGCTAATTCGGATCC-3'。

1.7 各组小鼠血清Th1/Th2趋化因子、炎症反应指标水平检测 将血清标本、稀释液以及检测卡平衡至24℃，对检测卡进行编号后置于平台之上，配制标准液并按照1∶10比例对待测标本进行稀释，将血清标本、稀释后标准液置于酶标板中，使用酶标分析仪检测Th1/Th2趋化因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）及炎症反应指标（IL-22、IL-3）水平。

1.8 各组小鼠血清氧化应激指标水平检测 采用免疫透射比浊法。取3个清洁试管，并分别记作空白管、标准管、测定管，每管中添加350 μl缓冲液。此外，空白管添加蒸馏水 20 μl，标准管添加 TAOC、NO 标准液 20 μl，测定管添加血清标本20 μl，震荡均匀，27℃静置10 min，使用分光光度计比色，500 nm波长处以空白管调零，记录吸光度值，计算TAOC、NO水平。

1.9 各组小鼠肺组织 TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达水平检测 采用Western blot法。提取各组小鼠肺组织总蛋白，取蛋白质样本20 μg，SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜，室温封闭1.5 h，1:1 000加入待测蛋白抗体，1:2 000添加内参抗体，过夜孵育，次日取出，TBST液清洗后1:5 000添加稀释后二抗孵育，1 h后使用TBST液洗涤5次，显色、曝光、成像后检测条带灰度值。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理学改变情况比较 正常组小鼠气道上皮完整，细胞排列整齐且紧密，结构较为清晰，大小均一，无炎性细胞浸润情况；哮喘组、上调组小鼠出现严重气道壁增厚情况，细胞排列杂乱且疏松，炎性细胞浸润情况较为严重；下调组小鼠气道壁增厚情况明显减轻，细胞排列较为整齐，结构较为清晰，炎性细胞浸润状况明显减轻，见图1（插页）。

图1 各组小鼠肺组织病理学检查所见（a：正常组；b：哮喘组；c：上调组；d：下调组；HE染色，×400）

2.2 各组小鼠miR-31、CD44 mRNA表达水平比较 与正常组比较，其他3组小鼠miR-31、CD44 mRNA表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与哮喘组、上调组比较，下调组小鼠miR-31、CD44 mRNA表达水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠miR-31、CD44 mRNA表达水平比较

2.3 各组小鼠Th1/Th2趋化因子水平比较 与正常组比较，其他3组小鼠IFN-γ水平均降低，IL-2、IL-4水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与哮喘组、上调组比较，下调组小鼠IFN-γ水平升高，IL-2、IL-4水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠Th1/Th2趋化因子水平比较（ng/L）

2.4 各组小鼠氧化应激、炎症反应严重程度比较 与正常组比较，其他3组小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与哮喘组、上调组比较，下调组小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠氧化应激、炎症反应严重程度比较

2.5 各组小鼠TGF-β1/Smad3信号通路蛋白水平比较 与正常组比较，其他3组小鼠TGF-β1、Smad3水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与哮喘组、上调组比较，下调组小鼠TGF-β1、Smad3水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠TGF-β1/Smad3信号通路蛋白水平比较

2.6 各组小鼠TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白水平比较 与正常组比较，其他3组小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与哮喘组、上调组比较，下调组小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表5 各组小鼠TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白水平比较

3 讨论

哮喘是一种临床常见的、易反复发作的呼吸系统疾病[9]，主要临床表现为胸闷、咳嗽、喘息等。目前哮喘的发病机制尚未明确，过敏、呼吸道感染、运动、外界刺激等均为常见的导致哮喘发病的危险因素[10-11]。临床常用的治疗哮喘的手段为糖皮质激素药物治疗，但研究发现长时间使用糖皮质激素治疗会出现临床疗效下降、不良反应增加、病情复发等情况，因此寻找一种安全有效的治疗手段成为目前哮喘研究的主要方向[12-13]。

miRNA广泛存在于多数生物体之中，miRNA水平变化与微生物感染、炎症反应及机体免疫状态等病理学改变均有一定的关系，越来越多的专家学者致力于miRNA在哮喘发生、发展过程中的作用研究[14-15]。有研究表示，miRNA在机体气道炎症反应中具有重要作用，miR-31为miRNA家族的重要组成成员，其水平变化对T细胞活化、机体炎症反应具有一定的调控作用[16]。CD44为广谱的细胞黏附因子，对炎症细胞增殖、聚集具有一定的促进作用。有研究表示，CD44水平变化与机体炎症反应、免疫反应具有密切联系，参与哮喘的发生、发展[17-18]。本研究发现，哮喘模型小鼠miR-31、CD44 mRNA水平较高，下调miR-31的哮喘小鼠CD44 mRNA水平下降，说明下调miR-31能够调控CD44 mRNA表达水平，从而对哮喘模型小鼠起到一定的治疗作用。

目前哮喘的发病机制尚未明确，有研究表示，Th1/Th2趋化因子水平变化与哮喘患者免疫应答具有密切联系[19-20]。IFN-γ、IL-2、IL-4 为广谱的 Th1/Th2 趋化因子，本研究发现，哮喘模型小鼠IFN-γ水平较低，IL-2、IL-4水平均较高，下调miR-31的哮喘小鼠IFN-γ水平上升，IL-2、IL-4水平均下降，出现这一研究结果的原因可能是下调miR-31能够调节哮喘小鼠Th1/Th2平衡，从而改善免疫功能，减轻哮喘小鼠炎症反应。

大量实验研究表明，哮喘症状的发生、发展与机体气道氧化应激、炎症反应具有密切联系[21-22]。TAOC、NO是常用的评价机体氧化应激反应的指标；IL-22、IL-3是常用的评价机体炎症反应的指标，两者水平变化与机体炎症反应密切相关。本研究发现，哮喘模型小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均上升，说明哮喘的发生、发展伴随着氧化应激反应、炎症反应。本研究还发现，下调miR-31 的哮喘小鼠 TAOC、NO、IL-22、IL-3 水平均下降，说明下调miR-31能够减轻哮喘模型小鼠气道氧化应激反应、炎症反应的严重程度。

气道重塑为哮喘发生、发展过程中的标志性病理变化，在哮喘发生、发展过程中具有重要作用。TGF-β1/Smad3信号通路对哮喘气道重塑具有一定的调控作用，对哮喘患者病情发展、肺功能变化具有重要意义。本研究发现，哮喘模型小鼠TGF-β1、Smad3水平均较高，下调miR-31的哮喘小鼠TGF-β1、Smad3水平均下降，出现这一研究结果的原因可能是哮喘小鼠伴有气道重塑，下调miR-31能够对TGF-β1/Smad3信号通路蛋白水平造成一定影响，从而起到改善哮喘模型小鼠气道重塑的作用。

本研究发现哮喘症状的发生、发展伴随着炎症反应，因此本研究对调控miR-31水平改善炎症反应的作用机制进行研究。TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白水平与机体炎症反应具有密切联系，参与气道炎症反应的发生、发展。本研究发现，哮喘模型小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均较高，下调miR-31的哮喘小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65 水平均下调，出现这一研究结果的原因可能是下调miR-31能够靶向TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白水平，从而起到抑制哮喘小鼠气道炎症反应的作用。

综上所述，下调哮喘小鼠miR-31，能够调控CD44 mRNA水平，调节Th1/Th2平衡，减轻哮喘小鼠氧化应激反应、炎症反应的严重程度，其作用机制可能与调控TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信号通路蛋白水平有关。