依赖SRP对大肠杆菌膜蛋白定位的研究

崔博显，赵留群，赵胜，杨建德,通信作者，刘燕霏，张大伟,通信作者

依赖SRP对大肠杆菌膜蛋白定位的研究

崔博显1，赵留群2，赵胜1，杨建德1,通信作者，刘燕霏1，张大伟2,通信作者

（1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300392；2.中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津 300380）

大肠杆菌中，信号肽识别颗粒（signal recognition particle，SRP）识别并绑定核糖体正在翻译的信号肽，引导新生肽链到细胞膜上。根据靶向膜蛋白生物素酰化原理，本研究利用Western blot方法，对构建的HDB51菌株及野生型菌株MG1655进行大肠杆菌膜蛋白定位研究。对比不同菌株中是否含有SRP，结果发现，在缺失SRP的HDB51菌株中检测到依赖SRP的底物蛋白FtsQ 的定位，缺失SRP 明显影响了FtsQ的定位，SRP具有辅助膜蛋白定位的功能，从而为研究依赖SRP性大肠杆菌膜蛋白定位提供理论依据。

大肠杆菌；信号肽识别颗粒；膜蛋白定位；FtsQ

大肠埃希氏菌（简称）通常也被称为大肠杆菌，Escherich在1885年发现大肠杆菌，且一直把它当作肠道中菌群的正常部分，所以大肠杆菌一开始被认为是非致病菌。到20世纪中期，才发现一些特殊血清型的大肠杆菌在人类和动物中都具有致病性，特别对于婴儿和幼畜（禽类），可导致败血症或严重腹泻。大肠杆菌是常见的原核生物之一，属于革兰氏阴性菌，其代谢活动能够有效抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，从而减少蛋白质分解后的产物对人体造成的危害。此外，大肠杆菌还可以合成维生素B和维生素K，以及含有杀菌功效的大肠杆菌素[1-3]。

信号肽识别颗粒（SRP）是普遍存在于真核和原核生物体中的蛋白质-RNA（Ffh-4.5S RNA）复合体，可介导共翻译转运蛋白的跨膜过程，也可引导翻译中的肽链进入膜上的转运通道[4-6]。大肠杆菌中SRP途径，主要识别内膜蛋白，这些蛋白在大肠杆菌中行使多种功能，如共翻译蛋离子、小分子及生物复合体的转运、细胞的分裂及细胞代谢等[7]。在大肠杆菌中，SRP识别并绑定核糖体正在翻译的信号肽。当信号序列从核糖体多肽通道出口出现时，SRP立即通过疏水作用识别信号序列并结合，从而形成SRP核糖体复合物（RNC•SRP），保证翻译转运同步正确进行。SRP是大肠杆菌生存所必需的，缺失SRP会对机体造成影响，引发一系列的生理应激效应，其中很重要的是依赖SRP底物的蛋白的错误定位或定位 失败[7-9]。

探讨依赖SRP的底物蛋白一直是国内外研究的热点。近来通过核糖体图谱技术，发现了依赖SRP的蛋白有87%是内膜蛋白，6%是间质/外膜蛋白，3%是细胞质蛋白，4%是未知蛋白[10]。本研究根据靶向膜蛋白生物素酰原理利用Western blot，对大肠杆菌膜蛋白定位进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

试验菌株如MG1655、HDB51 （Ampr，Kanr，基因由阿拉伯糖诱导表达），检测抗体及质粒包括p15A1-birA、p15A2-birA、pJH29-FtsQ-Avi、pJH29-EspP-Avi均有中科院工生所提供。

1.2 主要试剂

试验试剂如质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，Thermo公司的DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶，Solarbio公司的氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG诱导剂、阿拉伯糖、goldview染色剂、SSCS试剂、TBST缓冲液、TAE缓冲液、DAB显色液和LB培养基均购自Omega Bio-Tek公司。

1.3 质粒转化

具体方法参照文献[10]进行。将构建正确的质粒电转化分别转入不同感受态菌株中，获得含有p15A1-birA的两株MG1655（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）和含有p15A2-birA的两株HDB51（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）细菌。

1.4 蛋白定位的检测

挑取单菌落于5 mL LB培养基中，加入20 μg/mL的氯霉素。对于菌株HDB51，需要加入0.2%的阿拉伯糖诱导表达，37℃，220 r/min过夜培养。以1∶100稀释，加入到30 mL LB培养基中，相同条件下培养。其中HDB51加入或不加0.2%的阿拉伯糖，构建成含有SRP或缺乏SRP的菌株。

当OD值为0.5～0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达。同时加入终浓度为100 μmol/L生物素。培养3 h后，收集菌体，取出 1 mL菌液进行离心，7 000 r/min离心2 min，取上清 40 μL加入10 μL的5×loading buffer，然后用沸水煮20 min。

将获得的样品进行Western blot检测，转印的纤维膜用TBST稀释1∶200一抗温育1～2 h。用 TBST 在室温脱色摇床上洗3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin室温孵育1 h，用 TBST 在室温脱色摇床上洗3次，每次5 min。用DAB显色试剂盒显色，观察到目的条带。

试验中添加了不同浓度的IPTG（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L）诱导蛋白表达。

1.5 缺失SRP对膜蛋白定位的影响

试验采用大肠杆菌HDB51，此菌株的基因由阿拉伯糖诱导表达。在添加或不添加阿拉伯糖情况下，构成含有或缺乏Ffh的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株。在0.1 mmol/L IPTG作用下检测膜蛋白定位。

2 结果与分析

2.1 膜蛋白定位检测

本研究成功构建了表达生物素连接酶BirA和融合有标签Avi-tag（15个氨基酸，GLNDIFEAQKIEWHE）的靶蛋白EspP的质粒，且都在启动子Ptac作用下，由IPTG诱导表达。靶蛋白还融合有FLAG-tag作为内参，同时将两个质粒，转入野生菌MG1655。EspP是依赖SecA/B途径的底物蛋白，其C端位于细胞质，C端融合Avi-tag，可被生物素酰化，见图1。在不表达生物素连接酶BirA时，以FLAG标签可以检测到EspP蛋白的表达，但是没有检测到生物素酰化的EspP。

2.2 不同浓度 IPTG对FtsQ的生物素酰化的 影响

采用不同浓度的IPTG诱导，蛋白FtsQ最终的表达量无明显区别。但是，随着IPTG浓度增加，FtsQ的生物素酰化水平逐步升高，见图2，说明FtsQ的定位水平逐步降低。因此推测，高浓度的IPTG使部分FTsQ蛋白在胞内不能正确折叠，形成包涵体，从而在胞内积累，不能正确定位到膜上，造成生物素酰化水平升高。试验中选取的IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L，此时FtsQ蛋白刚好能全部定位到膜上，生物素酰化水平几乎为零。

2.3 缺失SRP对膜蛋白定位的影响

在添加或不添加阿拉伯糖情况下，构成含有或缺乏的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株，生长曲线如图3所示，在不添加阿拉伯糖时，菌株的生长受到明显抑制，说明大肠杆菌缺乏，蛋白的SRP转运途径有可能被阻断，导致有些膜蛋白不能准确定位，可能影响细胞的功能。

在野生型菌株MG1655及添加阿拉伯糖的HDB51菌株中，没有检测到生物素酰化的FtsQ，而在不添加阿拉伯糖的菌株HDB51，即缺乏SRP的菌株中，检测到了明显的条带，蛋白FtsQ定位水平约为60%，说明SRP的缺失导致FtsQ部分蛋白不能定位。作为对照的依赖SecA/B途径的蛋白EspP，无论是在野生型还是在缺乏SRP的菌株中定位水平基本一致，都在50%左右，见图4，说明SRP的缺失不会对非依赖SRP途径的底物蛋白产生影响。

3 讨论

基因融合系统被广泛应用于研究蛋白的分泌及膜蛋白的拓扑结构，例如融合碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及β-丙酰胺酶[11]。在这些研究中，采取的普遍策略是确定融合蛋白是否穿过细胞质 膜[12]。这些方法虽能够定性检测肽链是否穿过膜，但不能分辨膜突变体与野生型菌株的蛋白定位的速度变化，试验可选取可被生物素酰化的结构作为融合标签，来检测这种微妙变化[10]。若融合蛋白在穿过内膜之前，转运速度减慢，可以检测到明显的蛋白生物素酰化水平。通过构建灵敏检测膜蛋白定位的方法，探索SRP菌株的蛋白定位情况，已成为研究大肠杆菌中SRP功能的重要技术手段[13]。

本研究发现添加过量的IPTG时，虽然蛋白总体表达量并无明显区别，但蛋白的定位情况受到明显影响，推测过量的IPTG可能会对细胞产生毒性，同时使蛋白非正确折叠，不具有活性，在胞内积累，不能定位到膜上，影响试验结果。IPTG添加量在较低浓度时，膜蛋白FtsQ几乎全部定 位[9]。在大肠杆菌中，SRP识别并绑定核糖体正在翻译的信号肽，当信号序列从核糖体多肽通道出口出现时，SRP立即通过疏水作用识别信号序列并结合，从而形成RNC•SRP复合物，保证翻译转运同步的正确进行。SRP是大肠杆菌生存所必需的，缺失SRP会对机体造成毒性，引发一系列的生理应激效应，其中很重要的是依赖SRP底物蛋白的定位错误或失败[14]。本研究利用构建的膜蛋白定位方法，以FtsQ为模式蛋白，检测出SRP具有辅助膜蛋白定位的功能，为研究此类依赖SRP膜蛋白定位提供参考依据。

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Localization ofmembrane proteins dependent on SRP

Cui Boxian1, Zhao Liuqun2, Zhao Sheng1, Yang Jiande1,CorrespondingAuthor, Liu Yanfei1, Zhang Dawei2,CorrespondingAuthor

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

In,signal recognition particle（SRP）recognizes and binds signal peptides being translated by ribosome to guide the new peptide chain to the cell membrane.In this experiment, localization ofmembrance protein in HDB51 and MG1655 was studied by Western blot based on biotinylation for membrane proteins targeting.By comparing the presence or absence of SRP in different, the substrate protein FtsQ that depended on SRP in the strainHDB51 was localized.The location of FtsQ was significantly affected without SRP.This verifies that SRP helps membrane protein localization.It can provide references for the study of localizingmembrane proteins dependent on SRP.

; signal recognition particle; membrane protein localization; FtsQ

1008-5394（2021）03-0061-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.013

Q816

A

2019-10-22

天津市自然科学基金（16JCYBJC23500）

崔博显（1996—），男，本科在读，研究方向：微生物发酵。E-mail：sealmp5@qq.com。

杨建德（1969—），男，教授，博士，研究方向：预防兽医学。E-mail：jiandeyang@126.com。

张大伟（1978—），男，研究员，博士，研究方向：微生物发酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。

责任编辑：张爱婷