基于网络药理学探讨余甘子叶总黄酮抗结直肠癌的分子机制及活性成分

黄燕，邹天骏，罗雪菲，钟振国，兰太进

1.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；3.广西中医药大学科学实验中心，广西 南宁 530200

中药在肿瘤的治疗和预防中发挥着重要作用，具有多靶点和低毒性的特点[1-2]。余甘子Phyllanthus emblicaL.是大戟科Euphorbiaceae 叶下珠属Phyllanthus落叶小乔木或灌木，在我国分布广泛，资源丰富。全世界约有17 个国家的传统药物体系中使用了余甘子，我国约有16 个民族使用该药[3]，其被2015 年版《中华人民共和国药典》收载，以果实入药[4]。在民间，余甘子常用于治疗胆道疾病、支气管炎、糖尿病等，也以根和叶入药[5]。研究表明，余甘子叶具有广泛的药理活性[6]。目前认为黄酮类是余甘子叶的主要活性成分，并已鉴定出多种黄酮类化合物[7]。余甘子叶总黄酮（total flavonoids fromPhyllanthus emblicaleaves，TFPL）可抑制多种肿瘤的增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡[8-9]，但其调控机制和活性成分尚不甚清楚。本研究采用网络药理学方法，系统探究TFPL抗结直肠癌的分子机制及效应物质，为后续研究提供参考。

1 仪器、试药与细胞

Impact Ⅱ型超高分辨四级杆飞行时间质谱仪，美国Bruker Daltonic；Waters 2695-2489 高效液相色谱仪，美国Waters；SynergyTMH1 型多功能微孔检测仪，美国BioTek Instruments；3131 型二氧化碳培养箱，赛默飞世尔科技（中国）；STR16 型台式冷冻离心机，美国Thermo；BSA224S 型分析天平，北京赛多利斯；Omni-G 型独立超纯水系统，厦门锐思捷；SCQ-6201型超声波清洗仪，上海声彦；UV-2550 型紫外可见分光光度计，日本岛津；RE-5203 型旋转蒸发仪，上海亚荣；YRDC-0515 型低温恒温槽，上海亚荣；DHG-9203A 型电热恒温干燥箱，上海齐欣；HWS-24型水浴锅，上海一恒。

余甘子叶采自广西邕宁县，经广西中医药大学刘寿养教授鉴定为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥叶。1640 不完全培养基，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号KG 038784；胎牛血清，浙江天杭科技股份有限公司，批号18 070503；MTS，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号20 190304；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司，批号20 161212；甲醇（分析纯），成都科隆化学品有限公司，批号2018 030801；甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 178512；DMSO，美国SIGMA-ALDRICH 公司，批号SHBG3288V；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

人结直肠腺癌细胞COLO 320DM、DLD-1 均购自中国科学院细胞库，正常结直肠细胞NCM460 购自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 余甘子叶总黄酮制备

2.1.1 粗提取

取余甘子叶适量，粉碎成粗粉，加95%乙醇浸泡48 h 后进行渗漉，收集渗漉液；药渣干燥，加50%乙醇浸泡48 h，加同浓度乙醇进行渗漉，收集渗漉液。合并2 次渗漉液，减压浓缩，回收乙醇，得到浓缩液[10]。

2.1.2 纯化

将D101 大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分膨胀，用蒸馏水洗至无漂浮物，湿法装柱，沉淀24 h，浓缩液经温水溶解后上柱，吸附2 h，用蒸馏水洗脱，至洗脱液澄清透明，再依次用30%、50%、70%乙醇进行洗脱，洗脱液颜色变浅后，换梯度洗脱，洗脱液与盐酸-镁粉呈阳性反应后开始收集洗脱液。将收集的各梯度洗脱液混合，减压浓缩。用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层。减压浓缩，干燥处理成粉末，即得TFPL[10]。

2.2 细胞增殖实验

2.2.1 细胞种板

取对数生长期细胞，胰酶消化，得到单细胞悬液，细胞计数后调整至所需细胞量，置50 mL 离心管，加入培养基，定容至所需细胞悬液体积。吸取细胞悬液加入96 孔板，每孔100 μL，静置30 min 后移至细胞培养箱孵育。

2.2.2 药液配制

称取TFPL 适量，加入DMSO，超声溶解，制成0.05 g/mL 贮备液。吸取一定量贮备液，加入培养基，配成一定浓度药物母液，350 W、25 kHz 超声1 h。取母液，0.22 μm 针孔滤头过滤2 次。等度稀释法配制各浓度药液。

吸取一定量DMSO，加入培养基，制成不同浓度（0.1%、0.2%、0.5%）DMSO 对照药液，0.22 μm 针孔滤头过滤1 次。

2.2.3 分组与给药

分为7 个药物浓度组（22.5、45、62.5、90、125、180、250 μg/mL）及空白对照组、DMSO 对照组。每组4 个复孔，每个给药组另设2 个调零孔。种板第3日，吸出96 孔板中细胞培养液，加入100 μL 相应药液，于细胞培养箱孵育。

2.2.4 指标检测

给药24、48、72 h，每孔加入10 μL MTS，孵育2 h，于波长490 nm 处检测各孔光密度（OD），计算相对细胞活力（OD实验组÷OD对照组×100%）。采用Excel2013 计算IC50。

2.3 余甘子叶总黄酮成分分析

采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。

色谱条件：采用Agilent C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.5%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～10%B；10～10.01 min，10%～12%B；10.01～20 min，12%～13% B；20～30 min，13%B；30～60 min，13%～21%B），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式，毛细管电压3 500 V，雾化气压力2 bar，干燥气流速8.0 L/min，干燥气温度200 ℃；扫描模式为全扫描和auto ms/ms 扫描，扫描范围（m/z）50～1 300。

结合一级质谱和二级质谱碎片离子信息，依据文献检索结果，通过与Scifinder、Massbank、Chemspider数据库进行峰匹配检索，初步鉴定得到TFPL 化合物成分信息。

2.4 网络药理学分析

2.4.1 余甘子叶总黄酮成分-靶点关系网络构建

通过PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取TFPL 化学成分的Smile 数据，输入ChemMapper 数据库（http://lilab-ecust.cn/chemmapper），获得各成分相关靶点，通过Cytoscape3.7.1 软件构建TFPL 成分-靶点关系网络。

2.4.2 结直肠癌相关靶点收集

以“Colorectal Cancer”为关键词检索OMIM 数据库（http://www.omim.org/），得到结直肠癌相关靶点，通过Cytoscape3.7.1 软件构建结直肠癌靶点网络。

2.4.3 共有靶点筛选

比对TFPL 相关靶点与结直肠癌相关靶点，二者共有靶点即为TFPL 抗结直肠癌的潜在靶点。

2.5 分子对接

采用Sybyl X 2.0 软件评价关键靶点受体与化合物配体之间的结合能力。首先在PubChem 数据库中搜索得到化合物sdf 格式的结构，使用Open Babel GUI 软件将其转化为mol2 格式，导入Sybyl X 2.0 软件，进行能量优化并保存为mol2 格式文件。然后通过Protein Data Bank 数据库（https://www.rcsb.org/）搜索蛋白晶体结构并下载PDB 格式文件，导入Sybyl X 2.0 软件，对目标蛋白进行去除水分子、加氢原子等结构优化，并找到靶点蛋白的对接活性位点。最后将化合物配体与蛋白质受体相互作用，对接完成后通过所得的Total Score 评价配体与受体的结合作用，评分＞6.0 认为化合物与靶点具有较好的结合能力，以此筛选TFPL 抗结直肠癌的可能有效成分，使用PyMOL1.5.0.3 软件绘制对接结果示意图。

3 结果

3.1 余甘子叶总黄酮对结直肠癌细胞增殖的影响

TFPL 对COLO 320DM、DLD-1 细胞均具有较好的抑制增殖作用。TFPL 分别作用24、48、72 h，对COLO 320DM 细胞的IC50值分别为60.46、36.23、23.87 μg/mL，对DLD-1 细胞的IC50值分别为157.28、95.97、49.72 μg/mL。对正常结直肠细胞NCM460 则无明显抑制作用，IC50＞250 μg/mL。见图1。

图1 TFPL 对COLO 320DM、DLD-1、NCM460 细胞增殖的影响

3.2 余甘子叶总黄酮化学成分

初步鉴定得到TFPL 化学成分12 个（见表1），DAD 扫描图和一级质谱总离子流图见图2。

图2 TFPL 样品LC-MS/MS 图

表1 TFPL 化学成分LC-MS/MS 鉴定结果

3.3 网络药理学分析结果

通过ChemMapper 数据库收集到TFPL 中10 个成分对应的100 个靶点，Corilagin 和Chebulinic acid无相关靶点数据，结果见表2。去重后得到51 个靶点，成分-靶点网络见图3。通过OMIM 数据库收集到结直肠癌相关靶点192 个，见图4。通过比对筛选出TFPL 成分和结直肠癌疾病共有靶点EGFR，提示TFPL 抗结直肠癌作用的潜在靶点为EGFR。

表2 TFPL 成分及相关靶点

图3 TFPL 成分-靶点网络

图4 结直肠癌相关靶点网络

3.4 分子对接结果

EGFR 与Quercetin、Kaempferol 能够较好地结合（见图5、表3），这2 个化学成分可能是TFPL 抗结直肠癌的潜在活性成分。

表3 EGFR 与潜在活性成分对接得分

图5 EGFR 与Quercetin、Kaempferol 分子对接示意图

4 讨论

网络药理学建立在高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索基础上，从药物-靶点-疾病相互作用的整体性和系统性出发，采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质。相关数据库的建立和完善是网络药理学得以迅速发展的基础，一系列用于网络拓扑结构分析的算法、软件为网络药理学模型直观表达和数据分析提供了有力保障。网络药理学概念与中药及其有效组分多层次、多靶点的机制契合度较高，适宜研究中药多成分-多靶点的作用关系，有利于揭示中药及其有效组分的复杂作用机制[11]。

本研究通过LC-MS/MS 鉴定获得了TFPL 的12个化合物。利用网络药理学分析，筛选得出EGFR 可能是参与TFPL 抗结直肠癌作用的核心靶点。EGFR是一种跨膜蛋白，其过表达与多种肿瘤的发生发展有关[12]。通过阻断EGFR 在受体胞外结构域的结合位点，或抑制细胞内酪氨酸激酶活性，均可阻断EGFR信号传导，从而阻止肿瘤的生长[13]。分子对接结果显示，TFPL 中的2 个成分Quercetin、Kaempferol 可与EGFR 很好结合，进一步表明EGFR 可能是TFPL 抗结直肠癌的作用靶点。Quercetin 作为一种潜在的抗肿瘤药物已引起广泛关注，其机制包括抗氧化和抑制激酶信号转导等，其中包括EGFR[14]。Kaempferol 具有广泛的生物学特性，与EGFR 具有较强的结合能力[15]，对包括结肠癌在内的多种癌细胞具有诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用[16]。

综上所述，TFPL 可能通过其活性成分Quercetin、Kaempferol 作用靶点EGFR，达到抗结直肠癌作用，本研究可为余甘子叶的进一步临床应用和基础研究提供参考。