黄花倒水莲根结线虫病的病原鉴定

章淑玲 陈晓波 丁玲

摘要 2019年在福建省多个地方发现黄花倒水莲Polygala fallax遭受根结线虫的严重侵染，为明确病原线虫种类，运用形态学、rDNA-ITS序列分析及特异引物PCR扩增的方法对分离获得的根结线虫进行种类鉴定。结果表明，该病原线虫为南方根结线虫Meloidogyne incognita。黄花倒水莲根结线虫病在我国为首次报道。

关键词 黄花倒水莲; 南方根结线虫; 鉴定; 首次报道

中图分类号： S 435.67

文獻标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020212

Identification of the pathogen causing root-knot nematode disease in Polygala fallax

ZHANG Shuling， CHEN Xiaobo， DING Ling

（Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou 350119， China）

Abstract

In 2019， the severe infestation of Polygala fallax by root-knot nematode occurred in several places of Fujian province. In order to confirm the species of root-knot nematode， the nematode was identified by morphological observation， rDNA-ITS sequence analysis and PCR amplification using species-specific primers. The results showed that the root-knot nematode in P.fallax was Meloidogyne incognita. This is the first report of root-knot nematode disease in P.fallax in China.

Key words

Polygala fallax; Meloidogyne incognita; identification; first report

黄花倒水莲Polygala fallax Hemsl.为远志科Polygalaceae远志属Polygala植物，又称黄花远志、倒吊黄花、黄花参等。该植物可以根入药，具有益气补血、健脾利湿、活血调经的功效，主要用于病后体虚、腰膝酸痛、跌打损伤、黄疸肝炎等疾病的治疗，属珍贵的中药材[1]。由于黄花倒水莲花期长（长达3个月）、花色艳丽，还是一类重要的园林观赏植物。目前该植物主要分布于福建、广西、江西、云南等地的沟谷丛林中或山坡林地下[2]。当前市场上为满足人们对黄花倒水莲的药用和观赏价值的不断需求，规模化的人工培育种植是解决其野生资源不足的重要途径[3-4]。2019年在福建泉州、漳州、龙岩多地发现人工栽培的黄花倒水莲因受根结线虫病的严重危害而造成50%以上的减产。本研究对福建省多地发生的人工栽培黄花倒水莲根结线虫病进行了病害的调查、取样、病原线虫的形态学与分子生物学鉴定，明确其病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病害样本的采集

2019年采集福建泉州、漳州、龙岩等发病地染病的黄花倒水莲病株根茎及根系周围的病土，分别将病根茎连同周围的病土（约500 g）放入自封袋内，注明各病样的采集日期、地点、前茬作物及发病地的土壤类型等。采集到的样本带回实验室进行进一步的观察、分离与鉴定[5]。

1.2 线虫种群纯化与保存

于体视显微镜（Nikon SMZ745T）下分离黄花倒水莲病根组织中的单卵囊，分别接种到经灭菌培养的长有2～3片真叶的番茄苗根部，进行线虫种群的纯化与保存[5]。

1.3 病原线虫的形态学鉴定

用于形态鉴定的各虫态线虫均分离自单卵囊繁育的番茄根结线虫种群。雌虫经剖解病根组织所得;雄虫由改良贝尔曼漏斗法分离染病番茄的培养介质获得;2龄幼虫来自于番茄病根处的单卵囊孵化获得。供试线虫的杀死、固定及会阴花纹的制作方法参照张绍升[6]。各虫态线虫的体长、体宽、口针长、背食道腺开口至口针基部球的距离（DGO）和尾长等重要分类形态与特征值于Leica D6000显微镜下拍照、测量并用De Man公式进行计量[6-7]。各虫态分别取30个样本，形态拍照时除雌虫头部1 000×外其他虫态特征均在400×下进行。

1.4 病原线虫的分子生物学鉴定

1.4.1 DNA提取

病原线虫DNA的提取方法参照陈淑君等[8]。于体视镜下挑取1～3条2龄幼虫，用灭菌ddH2O清洗2～3次，加入到4 μL WLB（线虫裂解液）中，用无菌挑针将线虫切为2～3段，后用移液枪将含有线虫的悬浮液吸入含有1.2 μL蛋白酶K和17 μL WLB的Eppendorf管中，放入-20℃冰箱中冷冻过夜。次日取出置于PCR仪中65℃消化60 min，95℃灭活10 min，10 000 r/min离心2 min。离心后的上清液直接用于PCR扩增或置于-20℃冰箱中保存备用。

1.4.2 rDNA-ITS序列分析

选用的线虫ITS区通用引物V5367（5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和26S（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[9]由生工生物工程（上海）

股份

有限公司合成。25 μL PCR反应体系：2.0 μL DNA模板，12.5 μL 10×PCR Master Mixture，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，8.5 μL ddH2O。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR反应结束后取5 μL扩增产物在1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测，其余产物经铂尚生物技术（上海）有限公司進行双向测序。将获得的黄花倒水莲根结线虫rDNA-ITS序列与GenBank数据库中常见根结线虫序列进行Blast比对分析，后利用MEGA X软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，以自展法（bootstrap）进行1 000次检测[10]。

1.4.3 特异性引物检测

根据病原线虫的形态学与ITS序列分析结果，选用南方根结线虫特异性引物Mi-F（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′）和 Mi-R（5′-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3′）[11]对供试的福建省泉州、漳州、龙岩3个地理种群的黄花倒水莲根结线虫进行特异性PCR扩增。25 μL PCR反应体系，扩增的反应程序为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增后取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 病害症状

经调查发现黄花倒水莲受根结线虫严重侵染后，植株地上部表现出明显矮化，叶片失绿黄化，生长缓慢，甚至整株枯死（图1a）。受害根部表面出现许多粗糙、形状大小不一的根结，部分根结连成块状肿瘤，直径为健株根的2倍以上。随着病情加重，病根处的根结由黄褐色渐变成黑褐腐烂状（图1b～c）。剖解受害根组织可见球形或梨形的雌虫及埋生于根结内的褐色卵囊（图1d～e）。受害地块黄花倒水莲株发病率为20%～100%。

2.2 形态特征

雌虫呈球形或梨形，乳白色，有一明显的短颈，头区的骨质化不明显。口针较纤细，排泄孔位于口针基部球附近（图2a）。会阴花纹呈圆形或椭圆形，线纹较平滑或有波浪形纹，背弓较高;侧区的侧线不明显，阴肛区无明显线纹（图2b～c）。

雄虫为蠕虫形，体较长，头区骨质化较明显，无明显缢缩。口针较发达，排泄孔位于峡部附近，后食道腺从侧腹面覆盖于肠的前端（图2d）。侧区有4条明显的侧线;交合刺发达，无交合伞包被（图2e）。

2龄幼虫蠕虫形，体小，头区骨质化弱。口针纤细，基部球小，排泄孔位于食道腺前端，后食道腺从侧腹面覆盖于肠（图2f）。尾呈长锥形，末端有一清晰的透明区，常伴有1～2个缢缩（图2g）。

黄花倒水莲根结线虫形态测量值见表l。通过形态鉴定，黄花倒水莲根结线虫的分类特征与南方根结线虫Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood的描述相符[12-13]。

2.3 分子生物学特征鉴定

利用通用引物V5367/26S对福建省黄花倒水莲根结线虫的3个地理种群进行rDNA-ITS扩增与测序后均得到了768 bp序列，GenBank登录号为MT361637～MT361639。利用Blast比对分析显示供试的黄花倒水莲根结线虫与GenBank中南方根结线虫M.incognita（MH113856～MH113858，MH665425，MH734918，KP901064，AY438556，KC464469）的序列相似性达到99%～100%。利用MEGA X软件构建的系统发育树可以看出，3个地理种群的黄花倒水莲根结线虫与南方根结线虫的遗传距离最近（图3）。

根据以上形态及分子序列分析结果，利用南方根结线虫特异性引物Mi-F/Mi-R对黄花倒水莲根结线虫的3个地理种群进行PCR扩增，均扩增出大约1 000 bp的清晰条带，阴性对照没有条带（图4）。这一研究结果与文献报道一致[11]，以此可确定采集自福建省3个地方的黄花倒水莲根结线虫均为南方根结线虫。

3 结论与讨论

形态学结合分子生物学是当前植物寄生线虫种类鉴定的主要方法。线虫rDNA-ITS因其在种内高度的保守性和种间的变异性而广泛运用于种的分类鉴定。但南方根结线虫M.incognita、西班牙根结线虫M.hispanica、爪哇根结线虫M.javanica和花生根结线虫M.arenaria的rDNA-ITS序列同源性较高，可达99%以上[14-15]。本研究中黄花倒水莲根结线虫rDNA-ITS序列与南方根结线虫种群的同源性最高，与花生根结线虫和爪哇根结线虫也有较高的同源性，但结合供试线虫各虫态的形态描述及线虫种间特异性引物扩增条带的结果，最终鉴定福建省漳州、泉州、龙岩等多地黄花倒水莲的根结线虫为南方根结线虫M.incognita。黄花倒水莲根结线虫病为我国首次报道。黄花倒水莲为南方根结线虫的新寄主。南方根结线虫是一类分布广、危害重的病原线虫，受害寄主作物一般减产15%～20%，严重时达70%以上，每年造成的经济损失高达1 000亿美元[16-17]。本研究调查发现，在福建多地人工培植的黄花倒水莲出现长势衰退、叶黄、枯死等症状，多数是由于根结线虫侵染所致，而黄花倒水莲根结线虫病发生的地块多为砂质土壤，其前茬作物往往是上一年有发生根结线虫病的蔬菜类作物。因此，为预防人工栽培黄花倒水莲根结线虫病的发生，选择的栽培地必须是无病地块，尤其不能选择往年有根结线虫病发生的砂质地。幼苗移植前或定植后发现长势衰退的植株应检查根部是否有根结，一旦发现根结病株立即销毁并对周围植株施用噻唑膦或氟吡菌酰胺等杀线虫剂进行消杀处理。

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（责任编辑：田 喆）