哈茨木霉拌种对冬小麦生长、土传病害及根际真菌群落的影响

扈进冬 杨在东 吴远征 魏艳丽 杨合同 卢德鹏 李纪顺

摘要 為了明确哈茨木霉LTR-2拌种处理冬小麦的田间效果，为木霉拌种剂的推广应用提供依据，本试验于2016年-2018年连续3年，研究了哈茨木霉LTR-2拌种对小麦出苗率、幼苗生长、小麦纹枯病和茎基腐病发生情况和产量的影响，通过高通量测序和FUNGuild预测分析了木霉拌种对小麦根际土壤中真菌群落组成的影响。结果表明，哈茨木霉LTR-2拌种可以提高小麦的出苗率和冬前分蘖数;对小麦纹枯病的平均防效60%以上;对小麦茎基腐病的平均防效65%以上，优于6%戊唑醇悬浮种衣剂;与不拌种对照相比，哈茨木霉LTR-2拌种处理增产4.3%～634%，增产效果略高于6%戊唑醇悬浮种衣剂;木霉拌种可以降低小麦根际土壤中病原真菌的相对丰度，特别是土壤中镰孢属真菌的相对丰度。因此，哈茨木霉LTR-2可以作为化学拌种剂的绿色替代产品用于小麦生产。

关键词 哈茨木霉; 拌种; 冬小麦; 根际真菌群落

中图分类号： S 473

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020409

Effects of seed dressing treatment with Trichoderma harzianum on the growth of winter wheat seedlings， soil borne diseases and rhizosphere fungal community

HU Jindong1， YANG Zaidong2， WU Yuanzheng1， WEI Yanli1， YANG Hetong1， LU Depeng3， LI Jishun1*

（1. Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology， Institute of Ecology， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250103， China; 2. Shandong Luyan Quality Breeds Co.， Ltd.，

Jinan 250100， China;  3. Shandong Tenov Pesticides Co.， Ltd.， Weifang 262200， China）

Abstract

This study aimed to verify the field effects of seed dressing treatment with Trichoderma harzianum LTR-2 on winter wheat， and provide a basis for the promotion and application of Trichoderma seed dressing agents. The effects on wheat emergence rate and seedling growth， the incidence of wheat sharp eyespot and crown rot and yield were studied for three consecutive years from 2016 to 2018 after T.harzianum LTR-2 seed dressing treatment. At the same time， high-throughput sequencing and FUNGuild were used to analyze the fungal communities in rhizosphere soil of wheat between T.harzianum LTR-2 seed dressing and the control. The results showed that T.harzianum LTR-2 seed dressing could increase wheat emergence rate and tiller number before winter. The average control effects reached over 60% against wheat sharp eyespot， and over 65% against crown rot， which was better than tebuconazole 6% FSC treatment. Compared with the control， T.harzianum LTR-2 seed dressing treatment increased wheat yield by 4.3%-6.34%， which was also slightly better than tebuconazole 6% FSC treatment. Through the analysis of fungal community， we found that T.harzianum LTR-2 seed dressing could reduce the relative abundance of pathogenic fungi in wheat rhizosphere soil， especially the abundance of Fusarium spp. Therefore， T.harzianum LTR-2 can be used as a good substitute for chemical seed dressing agent in wheat production.

Key words

Trichoderma harzianum; seed dressing; winter wheat; rhizosphere fungal community

种子包衣是促进农作物增产丰收的一种重要技术措施，种子包衣可以防治土传病害和地下害虫，促进植株生长发育，提高作物产量、质量，增加农民收入，是我国重点推广的一项农业高新技术[1-3]。小麦在我国种植面积仅次于水稻，约2 400万hm2，是我国重要的主粮作物[4]。近年来伴随着农业种植制度改革，高产品种的应用推广，耕作方式的变化以及秸秆还田技术的推广应用，土传病害有不断加重的趋势，如纹枯病、茎基腐病等小麦土传病害发生日趋严重，这些病害已经成为影响我国小麦产量和质量的重要因素，尤其是小麦茎基腐病近年来发病率逐年增加，已经成为影响小麦安全生产的主要病害。目前戊唑醇、苯醚甲环唑、咯菌腈等化学杀菌剂常用于拌种防治小麦病害，拌种处理时化学杀菌剂选择和使用不当，会对小麦生长发育产生药害，导致出苗推迟、出苗率低、畸形苗等[5-7]。同时，化学农药长期连续使用易造成病原菌的抗药性，导致农药残留，不利于农业的可持续发展。

木霉LTR-2是本实验室分离的一株生防菌，经鉴定为哈茨木霉Trichoderma harzianum。其对蔬菜灰霉病菌Botrytis cinerea、小麦纹枯病菌Rhizotonia cerealis、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum等多種植物病原真菌具有较强的抑制作用，已被用于黄瓜灰霉病、小麦纹枯病的防治[8-10]。其作为生物肥料使用还具有促生增产的作用，同时还可以缓解土壤盐渍化对作物造成的损害[11-12]，是一株非常有开发潜力的生防菌株，但目前主要以喷雾、穴施、蘸根等方式使用，拌种仅用于小麦纹枯病的防治。为了充分开发哈茨木霉LTR-2在小麦拌种方面的应用潜力，了解其对小麦生长及产量的影响，以及对小麦茎基腐病的防治效果，本研究利用哈茨木霉LTR-2制备的拌种剂（以下简称木霉拌种剂）在山东泰安岱岳区开展了为期3年的木霉拌种田间应用试验，同时在第3年采用高通量测序方法对小麦根际真菌群落进行了跟踪分析，以期为木霉种衣剂的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为‘济麦22，泰安登丰种业有限公司提供;木霉拌种剂（含2亿哈茨木霉LTR-2活孢子/g）：山东省科学院生态研究所制备，对照药剂为6%戊唑醇悬浮种衣剂（FSC），以色列马克西姆化学公司。

1.2 试验地概况

试验田块位于山东省泰安市岱岳区大汶口镇，面积8 704 m2，其中测试处理区分为两块，面积均为3 808 m2，空白对照区面积为1 088 m2，不设重复，2016年-2018年连续种植3年小麦。试验田块地势平坦，肥力中上等，pH 6.3，土壤碱解氮含量126 mg/kg，有效磷含量28.5 mg/kg，速效钾含量114 mg/kg，有机质含量1.9%左右，土壤含水量适中，小麦种植前茬作物为玉米，收获后全部粉碎并还田处理。播种前施用硫酸钾复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15，湖北新洋丰肥业股份有限公司生产）750 kg/hm2作为基肥，返青拔节期追施尿素225 kg/hm2（鲁西化工集团股份有限公司生产）。播种量150 kg/hm2，机械播种。试验时间2015年10月14日-2016年6月5日，2016年10月10日-2017年6月8日，2017年10月15日-2018年6月8日。

1.3 处理剂量和处理方法

处理1：木霉拌种剂，以100 g制剂拌10 kg种子;处理2： 6%戊唑醇悬浮种衣剂，以10 mL制剂拌10 kg种子;空白对照不拌种。

1.4 数据调查

出苗率调查：每处理选取种子300粒，分3份每份100粒，3个处理共分9行，人工种植于相邻地块，各处理随机排列，用于出苗率和苗期生长状况调查，小麦播种后7 d左右调查各处理小麦出苗情况，记录出苗时间，齐苗时（播种后15 d）进行出苗率调查。

小麦越冬前生育指标调查：小麦越冬前停止生长时（每年12月10日左右）调查各小区小麦的株高、分蘖数量、鲜重等。

小麦纹枯病调查：参照GB/T 17980.108-2004农药田间药效试验准则（二）第108部分：杀菌剂防治小麦纹枯病[13]。

小麦茎基腐病调查：试验地块从2017年开始发现茎基腐病发生，故本试验从2017年开始茎基腐病调查，调查方法参照张鹏等病害分级标准[14]。

小麦收获期测产：采用收割机收割实际测产。

1.5 小麦根际土壤真菌群落分析

于2017年-2018年冬小麦田间试验期间，播种后30、60、150、180、210 d分5次（分别代表苗期、分蘖期、返青期、拔节期、抽穗期）采集木霉拌种处理和空白对照不拌种的小麦根际土壤。采样方法：小区前、中、后分3部分作为重复处理，每部分随机取5个样点，每样点随机选取10株麦苗，挖出根系，用抖根法采集附着在根际表面的土壤，混匀后为该样点的根际土壤样品，将土壤样品过20目细筛，取03 g根际土壤，按E.Z.N.A.soil DNA kit （OMEGA， USA） 土壤微生物DNA提取试剂盒的试验步骤提取土壤微生物总DNA，-20℃保存。

上述样品由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序，测序选用TS3/TS4通用引物，并由Illumina Miseq PE300测序平台完成。

1.6 数据处理与统计分析

小麦生长及木霉防治土传病害数据采用Excel （Ver.2013）进行统计分析，差异显著性分析采用Duncan氏新复极差法。

高通量测序完成后经过数据处理获得在97%相似水平下的OTU表，在此基础上本文重点考察了木霉拌种处理对小麦根际真菌群落功能类群的影响，使用FUNGuild数据库（http：∥www.stbates.org/guilds/app.php）[15]进行真菌功能预测分析。木霉拌种处理后根际土壤真菌FUNGuild功能分类组成和镰孢属相对丰度使用R语言（3.6.1）ggplot2包绘制[16]。

2 结果与分析

2.1 木霉拌种剂对小麦出苗及麦苗素质的影响

2016年-2018年3年田间试验表明，木霉拌种提高了小麦的出苗率（图1a），出苗率较不拌种对照增加了2.2%～2.6%，但二者之间差异不显著;与化学药剂6%戊唑醇FSC拌种相比，2016年和2018年出苗率显著增高（P<0.05）。冬前幼苗素质调查结果表明，木霉拌种后，株高在2016的试验中，鲜重在2017的试验中显著高于空白对照，其他年份，这两个指标与不拌种处理、化学拌种处理相比略有提高（图1b、图1c），但差异不显著;木霉拌种处理的冬前分蘖数较不拌种处理显著增加（P<0.05），平均增加0.51～0.7个（图1d），并且2016年-2018年连续3年试验结果一致。

2.2 木霉拌种对小麦纹枯病和茎基腐病的防治效果

试验结果（表1）表明，木霉拌种对小麦纹枯病和茎基腐病均有较好的防治效果。6%戊唑醇FSC拌种的试验田块2016年—2018年纹枯病病情指数整体趨于稳定，而茎基腐病病情指数呈增长趋势;木霉拌种处理田块对小麦纹枯病3年的防治效果为6017%～69.52%，除2016年外，木霉拌种处理防治效果略低于6%戊唑醇FSC拌种处理;木霉拌种处理对小麦茎基腐病两年的防治效果分别为6526%和6773%，其中2018年的防治效果显著优于6%戊唑醇FSC拌种处理，田块中茎基腐病病情指数也趋于稳定。

2.3 木霉拌种处理对小麦产量的影响

2016年-2018年连续3年对试验田块采用收割机采收实际测产，测产结果见表2，可以看出木霉拌种处理和6%戊唑醇FSC拌种处理比不拌种处理分别增产4.30%～6.34%和0.36%～3.47%，以木霉拌种和6%戊唑醇FSC拌种3年的增产率作为3次重复做差异显著性分析，结果表明，木霉拌种处理显著优于6%戊唑醇FSC拌种处理（P=0.04），说明木霉拌种剂可以作为化学杀菌剂的绿色替代品用于小麦拌种，降低化学农药使用。

2.4 木霉拌种对小麦根际真菌群落的影响

根据FUNGuild数据库在线比对结果，对木霉拌种和未拌种两组小麦根际土壤真菌的guild分类进行了统计分析，结果如图2所示，木霉拌种处理的小麦5个不同发育时期除分蘖期外，根际真菌群落中植物病原菌类群的相对丰度均比未拌种组有所降低，特别是在苗期和返青期。

此外，我们依据OTU表分类注释结果对根际土壤中镰孢属真菌的含量进行了比较，结果如图3所示，发现伴随小麦的生长，根际中镰孢属真菌含量呈现逐步增加的趋势，而通过木霉拌种处理可以有效降低根际土壤中镰孢菌的相对含量，其中木霉拌种后在分蘖期根际镰孢菌相对含量显著降低（P<0.05），推测这应该是木霉拌种可以有效防治镰孢菌引起的小麦茎基腐病发生的重要原因之一。

3 讨论

木霉可促进植物生长已广为认可，其对蔬菜，粮、棉、油作物，花卉、牧草等植物均有促生作用。其促生机制主要有：产生植物生长调节剂，如吲哚乙酸、玉米素、赤霉素等[17-18];产生可以抑制和降解根际有害物质，抑制土壤病原真菌的代谢产物;提高植物营养利用能力等[19]。不同的木霉促生机制不同，但大多是多种促生机制协同作用。从本研究进行的3年木霉拌种田间试验可以看出，木霉拌种可以促进小麦种子提前萌发，拌种小麦一般较不拌种小麦提前1～2 d出苗，并且出苗率增加2.2%～26%，苗期麦苗的素质也有所提高，其中冬前分蘖数明显增加。我们在对哈茨木霉LTR-2代谢产物进行分析时发现它可以分泌一些植物生长调节剂，如吲哚乙酸、赤霉素等，推测这可能是木霉拌种提高小麦冬前分蘖数的一个重要原因，而冬前分蘖数的增加为小麦成穗增产提供了可靠保障。

同时，木霉拌种对小麦纹枯病和茎基腐病等土传病害控制效果明显，可以显著降低小麦苗期的病情指数，减少小麦成熟期白穗率。采用高通量测序对小麦根际真菌群落的分析表明，木霉拌种降低了小麦根际病原真菌丰度，木霉拌种的小麦根际土壤中镰孢菌的相对丰度（2.25%～16.02%）在小麦多个发育时期较不拌种处理小麦根际土壤中的镰孢菌相对丰度（614%～21.68%）有所降低，这个结果很好地印证了FUNGuild预测的结果，然而，高通量测序结果发现丝核菌仅在未拌种对照的抽穗期中存在少量的reads，其他处理和时间段均未出现丝核菌reads，这一结果和我们田间调查结果不一致，究其原因可能与扩增子测序选用的真菌ITS扩增区域有关，该区域可能并不适用于丝核菌的有效扩增，此外，采集的根际土壤中丝核菌相对丰度比其他真菌低，不易检测也可能产生上述结果。对于这一问题，在今后的试验中我们希望通过提高测序通量或采用针对丝核菌特异序列的qPCR检测方法来探查和印证。

综上所述，木霉拌种处理降低了土壤中病原真菌总体丰度，减少了小麦土传病害发生，是小麦产量提高的一个重要因素。3年的田间应用数据表明，木霉拌种处理与不拌种处理相比稳定增产4%以上，同时木霉是一种环境友好型绿色生物制剂，可用于替代化学杀菌剂防治小麦土传病害，降低化学农药使用量，实现作物病害绿色防控，因此具有巨大的应用推广前景。

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（责任编辑：杨明丽）