不同轮作方式对马铃薯根际土壤真菌群落结构的影响

韩芳 ，包媛媛，刘项宇，张新永*，韦灯会，张浩然，田清龙

1. 云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2. 昭通市农业科学院，云南 昭通 657000；3. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201

马铃薯（Solanum tuberosum L.）为茄科茄属一年生草本植物，具有广泛的适应性，在海拔4000 m以下，从赤道到南北纬40° 的地区均可种植（刘洋等，2014）。基于中国马铃薯总产高、单产低的现状，在推进马铃薯主粮化的战略背景下（罗善军等，2018），其种植面积不断扩大。但随之而出现了连作导致土壤养分失衡、环境恶化、病害增多等问题。昭通市常年种植马铃薯面积在20×104hm2左右，是中国马铃薯的主产区之一。荞麦（Fagopyrum esculentum）面积3.5×104hm2左右，赤小豆（Vigna umbellata）也是该市的重要作物，在当地种植面积较大。随着马铃薯栽培面积不断增加，部分地区连作已不可避免，这3种作物之间的轮作在生产上也时有发生。轮作可改善作物残茬、控制病害及土壤侵蚀，使产量及经济效益得到提高。作物连作所造成的负面影响在很大程度上与土壤微生物环境有关（Roy et al.，1994），但可通过选择种植制度和轮作方式来调控土壤微生物，进而改善土壤肥力（Bucher et al.，2005；Li et al.，2015）。土壤微生物是影响作物生长环境的主要原因之一，对植物的生长发育起着非常重要的作用。微生物不仅能固定和分解有机质，使其成为土壤的有效养分，参与养分循环和植被利用过程，而且对土壤中某些无机物起到固定和维持作用，是土壤肥力变化的主要指标之一（何志刚等，2015）。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，参与土壤有机质的合成与分解，影响着土壤的一系列生化过程（Yanardag et al.，2017），作为指示土壤质量变化的因子，可作为评价土壤生态系统的功能与结构的指标（王娜等，2019）。Bunemann et al.（2014）研究发现，轮作效应对土壤微生物区系的影响远大于磷肥，猪屎豆-玉米轮作显著提高了真菌和细菌的丰度。轮作对土壤细菌和酶没有明显的影响，主要是对真菌数量有影响（Zhang et al.，2014）；真菌群落活动影响了植物的生长（李发虎等，2017）；在植物病虫害防治过程中发挥作用（Vanelsas et al.，2002）；根际土壤真菌多样性在维持土壤生态系统平衡和土壤质量方面具有重要作用（Knelman et al.，2014）。根际土壤直接受植物根系及其分泌物的影响，是土壤微生物与植物相互作用的重要场所，植物通过根系活动影响根际土壤的养分含量和理化性状，并改变根际微生物群落组成和多样性。同时，根际土壤微生物多样性和优势菌属的变化，也在一定程度上反映出土壤肥力和质量的变化趋势（Lynch，1990）。目前，对马铃薯与荞麦、赤小豆轮作根际土壤真菌群落变化的研究鲜有报道。本试验采用马铃薯、荞麦和赤小豆进行不同顺序的轮作，揭示不同种植顺序对作物根际土壤真菌群落数量变化的规律，为耕地的保护和马铃薯产业的可持续发展提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯品种选用“云薯505”，苦荞麦和赤小豆选用当地品种“线荞”和“红腰豆”。

1.2 试验地概况

试验地点为云南省昭通市靖安镇松杉村9社，海拔 2202 m，103°42′7″E，27°35′29″N。土壤类型为黄壤土类，典型黄壤土属，山地黄壤。土壤基本理化指标如表1所示。

表1 试验地土壤基本理化指标Table 1 Basic physical and chemical indexes of soil in the experimental site

1.3 试验设计

前茬作物为玉米。对土表厚度20 cm的土层进行充分混合均匀，采用随机区组设计，设置 9个小区即9个处理，每处理3个重复。小区宽5 m，长12 m，随机安排种植马铃薯、荞麦和赤小豆。2017年和2018年的3月中旬播种马铃薯，每0.067 hm2施用 50 kg 三元复合肥（mN꞉mP꞉mK=15꞉15꞉15），普钙40 kg，硫酸钾10 kg，一次性作底肥施用，双行垄作并覆盖地膜；4月中旬播种荞麦和赤小豆，施肥量均与马铃薯一致，3种作物均在播种当年的9月中旬收获并对根际土壤取样。马铃薯种植规格：每个小区共种10行，采用大垄双行种植，大垄距1 m，小行距0.4 m，株距0.4 m。荞麦：采用条播撒种，每个小区共种20行，行距0.25 m。赤小豆：每个小区共种10行，行距0.5 m，株距0.4 m。试验进行2年，每年一季作物，每小区种植作物情况如表2所示。

表2 作物轮作种植情况Table 2 The planting situation of crop rotation

取样：2018年9月中旬收获，同时进行作物根际土壤的取样，每小区采用“S”形 5点法采集 5—20 cm耕层的根际土壤，将取样点的作物根系从土中取出后收集附着在根系上的土壤，装入密封袋置于冰盒内，带回实验室，保存在−80 ℃冰箱中用于真菌群落的测定。真菌群落测定采用真菌 ITS1区相对定量测序的方法进行，引物序列如下：Primer F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；Primer R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。

1.4 数据处理

真菌群落相对定量测定数据使用USEARCH软件进行OUT聚类分析，使用mothur软件进行OTU分类学分析和物种注释统计，使用R绘图进行物种总丰度柱状图、群落结构柱状图、样本聚类树柱状图、Heatmap热图和PCA分析。数据差异显著性使用SPSS 25.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同轮作方式真菌群落多样性分析

土壤样品测序结果如表3，在97%相似水平上所建立的微生物文库，样本覆盖率在99%以上，说明试验所建立的文库能够真实地反映土壤样本微生物群落的 OTU组成，所反映的各样本的微生物物种信息的置信度高，具有真实性和研究意义。

表3 不同轮作方式根际土壤真菌群落的多样性Table 3 Diversity of fungal communities in rhizosphere soil under different rotation patterns

不同轮作方式的OUT数量、Chao1和ACE指数、Shannon和 Simpson指数皆有所差异，Chao1指数最高的是处理 F、H、A，其次为 C、D、G，最小为B、I、E。ACE指数最高的是处理F、H、A，其次为C、D、B，最小的是G、I、E。结合Chao1和ACE指数，得出处理F、H、A的真菌丰富度最高。Shannon指数最大的是处理F、A、H，其次为C、B、D，最小的是G、I、E。Simpson指数最小的是处理A、F、H，其次为B、D、C，最大的是G、I、E。结合Shannon和Simpson指数可看出，不同轮作方式，处理F、A、H的真菌多样性指数较高，而处理E和I较低。即：9个处理中，A（赤小豆连作）、F（荞麦-赤小豆）和 H（马铃薯-赤小豆）的真菌丰度和多样性较丰富，而处理E（马铃薯-荞麦）和I（荞麦-马铃薯）的则较低。

2.2 不同轮作方式真菌群落组成结构分析

实验结果如图1所示。共检测出10个真菌门类，分别是Ascomycota（子囊菌门）、Basidiomycota（担子菌门）、Mortierellomycota（被孢霉门）、Glomeromycota（球囊菌门）、Chytridiomycota（壶菌门）、Kickxellomycota（梳霉门）、Cercozoa（曳尾虫门）、Rozellomycota（罗兹菌门）、Olpidiomycota（油壶菌门）、Calcarisporiellomycota。各处理所含真菌门相似， Ascomycota所占比例在12.4%—56.8%之间，Basidiomycota占比8.4%—28.0%，Mortierellomycota占比5.3%—18.1%。各处理间的Ascomycota百分占比为 G>D>B>F>C>A>H>I>E，处理 G、D、B的Ascomycota含量显著高于其他处理，而含量最低的是处理I和E。Basidiomycota的百分占比为B>I>H>E>A>G>C>F>D。各处理的Mortierellomycota百分占比为C>D>G>F>A>B>H>I>E。

图1 不同轮作方式土壤真菌门水平群落组成及相对丰度Fig. 1 Composition and relative abundance of soil fungal phylum under different rotation patterns

Ascomycota（子囊菌门）、Basidiomycota（担子菌门）和Mortierellomycota（被孢霉门）在所有处理中占比最高；含量最丰富的是处理 B（马铃薯连作）、D（赤小豆-马铃薯）和G（赤小豆-荞麦），最低的是处理E（马铃薯-荞麦）和I（荞麦-马铃薯）；马铃薯连作在真菌门水平上的丰度高于赤小豆和荞麦的连作，而马铃薯和荞麦轮作的真菌丰度最低。

如图2所示，真菌属水平共检测出32种真菌属，不同处理在属水平上主要有Mortierella（被孢霉属）、Metacordyceps、Acremonium（顶孢霉属）、Saitozyma、Plectosphaerella（癣囊腔菌属）、Trechispora（糙孢菌属）、Vishniacozyma（维希尼克氏酵母菌属）、Spirosphaera（球旋霉属）、Boeremia、Fusarium（镰孢菌属）、Isaria（棒束孢属）、Cladophialophora（瓶霉属）、Clitopilus（陡盖菌属），所占比例均在1.22%—18.05%范围内，其余真菌属所占比例较低。通过真菌群落丰度比例可知，处理A的主要优势属的相对丰度为：Mortierella 8.78%、Metacordyceps 6.52%、Fusarium 3.75%；处理B的优势属的相对丰度为：Mortierella 7.69%、Trechispora 5.31%、Acremonium 3.27%；处理C的优势属的相对丰度为 Mortierella 16.43%、Trechispora 4.77%、Clitopilus 2.57%。而Mortierella（被孢霉属）是 3种作物连作的优势属，其余真菌属根据作物不同有较大差异。

图2 不同轮作方式土壤真菌属水平群落组成及相对丰度Fig. 2 Composition and relative abundance of soil fungal genus under different rotation patterns

两种相同作物，因种植顺序不同，对真菌优势属的影响也不同。马铃薯和赤小豆轮作：处理D（赤小豆-马铃薯）优势属的相对丰度为 Mortierella 18.05%、Boeremia 6.42%、Fusarium 4.67%；处理H（马铃薯-赤小豆）的优势属的相对丰度为Saitozyma 6.31%、Mortierella 5.27%、Metacordyceps 3.17%；马铃薯和荞麦轮作：处理E（马铃薯-荞麦）优势属的相对丰度为 Saitozyma 12.28%、Vishniacozyma 4.72%、Plectosphaerella 2.48%；处理I（荞麦-马铃薯）的优势属的相对丰度为 Saitozyma 16.08%、Plectosphaerella 8.38%、Vishniacozyma 5.87%。荞麦和赤小豆轮作：处理F（荞麦-赤小豆）的优势属的相对丰度为 Mortierella 11.14%、Vishniacozyma 3.17%、Plectosphaerella 2.32%；处理 G（赤小豆-荞麦）的优势属的相对丰度为Mortierella 11.56%、Trechispora 7.79%、Plectosphaerella 3.64%。

由此可见，不同的轮作方式对作物根际土壤真菌群落优势属的种类和丰度存在不同程度的影响，在9个处理中，连作真菌属多样性明显高于轮作的处理，马铃薯和荞麦的种植顺序对优势属的种类和丰度影响较小，处理E（马铃薯-荞麦）和处理I（荞麦-马铃薯）的真菌属水平多样性相对其他处理较低。而马铃薯和赤小豆的种植顺序对优势属的种类和丰度影响较大，其次是荞麦和赤小豆。

2.3 不同轮作方式真菌群落热图分析

根据 OTU丰度进行聚类，将高丰度、低丰度的物种模块聚集，通过颜色变化与相似程度来直观反映不同样品在属水平上群落结构的差异性和相似性，群落热图能够较为直观反应不同处理样品间真菌群落中物种组成相似性、差异性、物种聚类关系等情况。由图3可知，处理不同，根际土壤真菌优势属也不同。处理 A优势属为 Mortierella、Metacordyceps和 Fusarium；处理 B优势属为Mortierella、Acremonium、Metacordyceps；处理 C优势属为 Mortierella、Trechispora、Clitopilus；处理 D 优势属：Mortierella、Fusarium、Boeremia；处理 E优势属：Saitozyma、Vishniacozyma、Plectosphaerella；处理 F优势属：Mortierella、Vishniacozyma、Trechispora；处理 G 优势属：Mortierella、Plectosphaerella、Trechispora；处理H优势属：Saitozyma、Mortierella、Metacordyceps；处理 I优势属为 Saitozyma、Plectosphaerella和Mortierella。

热图聚类结果（图3）中，颜色代表物种丰度，纵向聚类表示不同物种在各处理间丰度的相似情况，两物种间距离越近，枝长越短，说明这两个物种在各样品间的丰度越相似；横向聚类表示不同处理间物种丰度的相似情况，与纵向聚类一样，两样品距离越近，枝长越短，说明这两个样品的各物种丰度越相似。由聚类树可知，处理B（马铃薯连作）和处理F（荞麦-赤小豆）的物种丰度差异最显著，处理B和处理D（赤小豆-马铃薯）、处理E（马铃薯-荞麦）和处理 I（荞麦-马铃薯）、处理 C（荞麦连作）和处理G（赤小豆-荞麦）、处理A（赤小豆连作）、F（荞麦-赤小豆）和处理 H（马铃薯-赤小豆）之间的物种丰度较为相似。

图3 不同轮作方式土壤真菌群落结构属水平的热图聚类Fig. 3 Thermal map clustering of soil fungal community structure at genus level in different rotation patterns

2.4 不同轮作方式对真菌群落组成的主成分分析

为了更直观的分析不同轮作方式对土壤真菌群落的影响，绘制了PCA分析图（图4）。PCA分析共提取了两个主成分PC1和PC2，二者方差累计贡献率为62.485%，说明这两因素是造成不同轮作方式土壤真菌群落差异的主要因素。图中各个点代表不同的处理，点距离越近，表示真菌群落结构越相似；点距离越远，表示真菌群落结构差异性越大。9个处理中，处理 E（马铃薯-荞麦）在主成分 1轴和2轴上与其他处理的距离都较远，其中最接近的是处理 H（马铃薯-赤小豆）和处理 I（荞麦-马铃薯）；处理F（荞麦-赤小豆）与其他处理在主成分1轴和2轴上都有一定距离，处理B（马铃薯连作）和D（赤小豆-马铃薯）、处理H和I在主成分1轴和2轴上距离较近。PCA分析结果表明，不同的轮作方式改变了土壤真菌群落的组成结构，且相同的作物，种植顺序不同，对真菌群落的结构也有较大的影响。

图4 同轮作方式土壤真菌群落结构PCA分析Fig. 4 PCA analysis of soil fungal community structure in the same crop rotation

3 讨论

土壤微生物对农作物的生长及养分获取具有重要的作用（Almario et al.，2013），其群落结构组成和多样性是土壤生态环境的重要生物指标（Bossio et al.，2006）。连作会降低土壤质量，单作环境下，作物的化感物质会影响土壤微生物群落，易形成连作障碍，不利于作物生产（Huang et al.，2013）。本研究结果表明，连作的真菌属水平上多样性高于轮作处理，这与马春梅等（2014）的研究结果一致。连作使微生物活性不断降低，真菌的比例明显升高，使土壤由细菌型向真菌型转化（顾美英等，2012）；大豆连作，土壤微生物总数差异不显著，但根际真菌相对数量较高，土壤微生物组成向真菌型转变（孟丽娜，2008）。细菌型是土壤肥力提高标志，真菌是土壤肥力降低的指示器（刘军等，2012）。在本研究中，马铃薯、赤小豆和荞麦对根际真菌群落结构有不同的影响，马铃薯连作使真菌群落丰度和多样性高于轮作，这与孙小花等（2019）研究结果一致。土壤真菌的群落结构和多样性受到土壤理化性质、化学因子等多方面的影响（王晓彤等，2019）；不同作物轮作方式对真菌群落结构变化的响应不同，作物根系向土壤中释放的多糖、氨基酸和酶类等化学物质使土壤环境形成了差异，对土壤真菌群落结构产生了影响（袁月等，2014）；长期的单一栽培和连作导致真菌群落多样性的变化，土壤真菌多样性随着连作年限的增加而增加（Li et al.，2019）。本研究显示，Ascomycota（子囊菌门）、Basidiomycota（担子菌门）、Mortierellomycota（被孢霉门）是 9个处理中优势门类，但每个处理所占比例不同，这是由于作物的改变显著改变了土壤的物理及化学性质进而影响了微生物的生存环境（陈桂香等，2017）。在优势属水平真菌的分析结果中发现，轮作方式对真菌属的影响较大，每个处理的优势属及所占比例不同。刘星等（2015）研究表明，马铃薯连作导致土壤微生物群落结构显著改变，病原菌成为优势种群，比如Fusarium（镰孢菌属）等土传病原真菌的数量显著增加，容易导致病害发生。本研究中，处理D（赤小豆-马铃薯）的轮作方式镰孢菌属占比最高，而处理E（马铃薯-荞麦）、I（荞麦-马铃薯）的占比较低，说明赤小豆和马铃薯的轮作方式更有利于镰孢菌属的繁殖，而马铃薯和荞麦的轮作方式在一定程度上抑制了镰孢菌属的繁殖，可以缓解镰孢菌引起的马铃薯土传病害，这与柴莹等（2018）的研究结果相似。土壤微生物群落多样性和组成，受到土壤理化性质和不同生境的影响，在不同的生境中，根际微生物群落存在差别（丁丽等，2020）。真菌群落结构的变化与植物生物量，真菌丰度和根际分泌物等变化有关（Shi et al.，2020）。因此，可通过不同的轮作方式定向调节土壤微生物群落结构，优化土壤生态结构，提高土壤肥力。

4 结论

马铃薯、赤小豆和荞麦不同的轮作方式，对土壤理化指标改善最明显的是处理E（马铃薯-荞麦）、I（荞麦-马铃薯）和 H（马铃薯-赤小豆）；荞麦与马铃薯的轮作方式优于其他处理。真菌丰度和多样性最高的是处理A（赤小豆连作）、F（荞麦-赤小豆）和H（马铃薯-赤小豆）；最小的是处理E（马铃薯-荞麦）和处理 I（荞麦-马铃薯）。优势门类是Ascomycota（子囊菌门）、Basidiomycota（担子菌门）和Mortierellomycota（被孢霉门）；最丰富的是处理 B（马铃薯连作）、D（赤小豆-马铃薯）和 G（赤小豆-荞麦）；最低的是处理 E（马铃薯-荞麦）和处理I（荞麦-马铃薯）；马铃薯连作在真菌门水平上的丰度高于赤小豆和荞麦的连作，而马铃薯和荞麦的轮作方式丰度最低。不同的轮作方式对作物根际土壤真菌群落优势属的种类和丰度存在不同程度的影响，在9个处理中，连作真菌属多样性明显高于轮作的处理。马铃薯和荞麦的种植顺序对优势属的种类和丰度影响最小，且处理E（马铃薯-荞麦）和处理I（荞麦-马铃薯）的真菌属水平多样性相对其他处理较低；而马铃薯和赤小豆的种植顺序对优势属的种类和丰度影响最大，其次是荞麦和赤小豆。所以，选择适宜的作物，比如荞麦进行轮作对于马铃薯生产的可持续发展是有利的。