2018—2020年大连市规模奶牛场副结核抗体检测分析

赵怡雯，苍真伟，刘 佳，胡永倩，李 巍，杨 卓，程淑晶，张玉平，于汉勋

（1.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116000；2.大连市畜牧总站，辽宁 大连 116000；3.大连市金弘基种畜有限公司，辽宁 大连 116000）

奶牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的慢性消化道疾病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。奶牛副结核病以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱褶[1-2]为特征。由于该病潜伏期长（1～2年）、病程长，细菌培养困难，在临床上很容易被误诊为其他细菌类腹泻疾病，使病牛得不到及时有效的医治，并且牛副结核分枝杆菌属于细胞内寄生菌，普通抗菌素不易进入细胞内，一旦出现临床症状则很难医治。由于病牛的反复腹泻常导致体重下降和产奶量降低，对奶牛场（户）造成严重的经济损失[3]。为了解奶牛场的牛副结核发病状况与净化效果，大连市畜牧总站从2018年开始到2020年连续3年对大连地区规模奶牛场进行采样检测，共采集样品3070份，对采集的样品进行了血清学检测。现将检测情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 血清样品

从大连地区多家规模化奶牛养殖企业（规模奶牛场存栏情况见表1）采集全血样品，分离血清后于4℃冰箱中保存，备用。

表1 规模奶牛场存栏情况

1.2 试剂

牛副结核抗体检测ELISA试剂盒（批号为8156），北京爱德士元亨生物科技有限公司生产。

1.3 主要仪器

酶标仪（型号为Multiskan MK3），美国Thermo⁃Multisk公司产品；96针全自动酶标洗板机（型号为PW-960Plus），深圳市汇松科技发展有限公司产品；生化培养箱（型号为SHP-250），上海森信实验仪器有限公司产品。

1.4 检测步骤

1.4.1 样品稀释

按照检测试剂盒的操作步骤，根据对照和待检血清ELISA板布局，对检测样品用样品稀释液进行100倍稀释，对阴阳对照进行20倍稀释。用微量反应板振荡器对反应板进行样品混匀。封板后于24℃温箱进行孵育1h。

1.4.2 预孵育样品和抗原结合

取100μL预孵育样品加入到已包被有抗原的微量反应板中，封板后于24℃温箱孵育45min。

1.4.3 加酶标抗体

用洗板机对孵育完成的反应板进行洗板5次，于拍板纸上拍干后，加入100μL已进行20倍稀释的酶标抗体。封板后于24℃温箱孵育30min。

1.4.4 加底物

用洗板机对孵育完成的反应板进行洗板5次，于拍板纸上拍干后加入100μL底物液。在避光环境下24℃温箱孵育10min。

1.4.5 加终止液

将孵育完成后的反应板加入100μL终止液，在酶标仪上进行读数。

2 结果与分析

2.1 检测结果

2018年共检测8家规模奶牛场，每场按最低20%的存栏量抽检，抽检样品总数为1767份，检测结果阳性为142份，阳性率为8.04%。2019年共检测10家规模奶牛场，每场抽检样品数为92份（其中一家抽检样品90份），抽检样品总数918份，检测结果阳性为19份，阳性率为2.07%。2020年由于受新冠疫情影响，只对3家规模奶牛场要净化转场的犊牛进行全部检测，检测样品总数为385份，检测结果阳性为32份，阳性率为8.31%。具体检测结果见表2。

表2 2018—2020年检测数与检测结果

2.2 结果分析

通过2018—2019年连续2年对规模奶牛场副结核抗体检测结果进行对比，可知大连地区规模奶牛场副结核的整体阳性率由8.04 %下降至2.07 %，出现了明显下降。同时，2年连续参与检测的8家规模化奶牛场副结核阳性率均呈下降趋势,2019年奶牛副结核检测阳性率明显低于2018年。分析原因有两点：一可能与当年副结核病的流行态势有关；二可能与采取的检测、隔离、消毒等净化措施有关。

2020年检测的3家规模化奶牛场其中有2家是连续3年都进行了检测，另外1家是2019—2020年2年连续进行检测，在2020年阳性率均出现了反弹现象。分析原因可能与当年检测的样品均为犊牛有关。

通过对表1和表2数据进行分析，结合养殖场饲养管理水平与生物安全控制措施，可以看出饲养管理水平高、生物安全措施管理到位，奶牛副结核的感染率相对较低，反之相对较高。因此，通过检测、隔离、消毒等综合防控措施是可以大大降低养殖场奶牛副结核的感染率，尤其是在目前没有特效治疗药物和疫苗免疫时，通过采取检测净化手段及综合防控措施是控制牛副结核病在场内传播行之有效的方法。

下一步应持续对大连市的规模奶牛场副结核感染情况进行检测，并重点对2020年检测的3家规模奶牛场及净化转场的犊牛群进行跟踪监测，条件允许时再开展副结核细菌的分离培养和分子生物学检测，以摸清副结核病在奶牛场的感染规律，探索出大连市规模奶牛场副结核病净化的综合防控措施与标准。