三种梅毒螺旋体特异性抗体检测方法性能评价

王娟梅 方孝美 宋 冰

海盐县人民医院检验科，浙江嘉兴，314300

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponemapallidum, TP)感染引起的以性接触传播为主的传染病，也可通过血液传播和母婴传播[1]。孕妇一旦感染,可导致胎儿早产、死产或娩出先天梅毒患儿。目前对于梅毒的实验室检测包括梅毒螺旋体检查和血清学检查，后者包括电化学发光免疫分析(ECLIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、免疫印迹实验(TP-WB)等。TPPA使用TP减毒株制备抗原，与血清中抗体产生凝集反应，具有较高的灵敏度、特异性，美国疾病预防控制中心推荐TPPA作为确诊方法[2]。ECLIA、CLIA、ELISA等检测方法具有较高的灵敏度，但均有一定假阳性，临床检测常出现几种方法结果不一致情况[3]。以往研究大多采用化学发光或ELISA筛查阳性后，再用TPPA确诊[4]，此方式无法真实判断试剂检测的灵敏度和特异性，本研究采用TPPA确诊标本来进行三种方法学的比较，具体研究如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 分析我院2020年6月至2020年12月间经TPPA确诊的梅毒特异性抗体阳性标本60例，阴性标本60例，其中男71例，女49例，年龄18～86岁，并收集患者是否有痛风、心脑血管、肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等基础疾病。

1.2 仪器与试剂 ECLIA由罗氏电化学发光分析仪(Cobas e602)及其配套试剂检测完成(批号：51677002)，CLIA由万泰生物Caris200及其配套试剂检测完成(批号：20200626)。TPPA检测试剂盒由日本富士瑞必欧株式会社生产(批号：20200603)，ELISA检测试剂盒由万泰生物生产(批号：N20200216)。

1.3 方法 实验前将-20℃冷冻保存血清标本取出后复融，以TPPA检测结果作为金标准，筛选TPPA阳性标本60例，阴性标本60例，分别通过ECLIA、CLIA、ELISA三种方法对标本同时进行检测，并严格设立阴性、阳性对照。ECLIA、CLIA从测试到结果完成均由仪器自动完成，根据试剂盒说明书，将S/CO≥1样本判断为阳性，S/CO<1则判断为阴性。ELISA的检测采用双抗原夹心法，按照试剂盒说明书，采用手工方法操作后酶标仪读取OD值。TPPA的检测采用手工操作，按照试剂说明书肉眼判读结果，反应孔中光滑纽扣样为阴性，出现凝集和不规则沉淀为阳性。比较三种方法不同S/CO区段TPPA检测结果，确定不同检测方法的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、符合率、Kappa值等。分析不同方法学间S/CO相关性，并建立一元回归方程，通过受试者工作曲线(ROC)判断不同方法学对梅毒的诊断价值，并确定S/CO最佳截断值，比较不同方法学AUC面积，了解与金标准检测结果不符样本的临床特征。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件建立数据库，两种方法检测结果差异分析采用配对卡方检验，两连续变量相关性分析采用Pearson相关性分析，通过ROC曲线比较不同方法学对梅毒的诊断效果，根据Youden指数最大时S/CO值作为最佳截断值，采用Medcalc软件进行AUC比较，研究采用z检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同方法学检测结果与TPPA检测结果差异比较 ECLIA、CMI法S/CO<1时，所有标本TPPA检测均为阴性，ELISA法S/CO<1时，其中2例样本TPPA检测为阳性。ECLIA法S/CO≥5时，TPPA检测阳性率为100.00%，CLIA法S/CO≥7时，TPPA检测阳性率为100.00%，ELISA法S/CO≥7时，TPPA检测阳性率为100.00%，见表1。

表1 不同方法学检测结果与TPPA检测结果 例(%)

2.2 不同检测方法S/CO相关性分析 ECLIA、CLIA法S/CO呈正相关，两者间函数为y=1.1131x-0.0339(R2=0.877)。ELISA、ECLIA法S/CO呈正相关，两者间函数为y=0.4907x+1.1931(R2=0.531)。ELISA、CLIA法S/CO呈正相关，两者间函数为y=0.5978x+1.008(R2=0.558)，均P<0.05。ECLIA、CLIA法S/CO R2值均明显高于ELISA与ECLIA法、ELISA与CLIA法(图1～3)。

图1 ECLIA、CLIA法S/CO散点图 图2 ELISA、ECLIA法S/CO散点图 图3 ELISA、CLIA法S/CO散点图

2.3 不同检测方法性能比较 ECLIA检测梅毒特异性抗体灵敏度为100.00%，特异性为93.33%，阳性预测值为93.75%，阴性预测值为100.00%，符合率为96.67%，Kappa值为0.933，ECLIA、TPPA两种方法检测结果差异无统计学意义(P=0.125)。CLIA检测梅毒特异性抗体灵敏度为100.00%，特异性为91.67%，阳性预测值为92.31%，阴性预测值为100.00%，符合率为95.83%，Kappa值为0.917，CLIA、TPPA两种方法检测结果差异无统计学意义(P=0.062)。ELISA检测梅毒特异性抗体灵敏度为96.67%，特异性为86.67%，阳性预测值为87.88%，阴性预测值为96.30%，符合率为91.67%，Kappa值为0.833，ELISA、TPPA两种方法检测结果差异无统计学意义(P=0.109)，见表2。

表2 三种检测方法性能比较 例

2.4 三种检测方法ROC曲线分析 ECLIA检测梅毒特异性抗体AUC为0.964(0.926～0.999)，S/CO截断值1.90时，Youden指数最高。CLIA检测梅毒特异性抗体AUC为0.946(0.903～0.989)，S/CO截断值2.20时，Youden指数最高。ELISA检测梅毒特异性抗体AUC为0.898(0.836～0.959)，S/CO截断值2.30时，Youden指数最高，见图4、表3。

表3 最佳截断值时不同方法检测性能

图4 三种检测方法ROC曲线分析

2.5 三种检测方法曲线下面积比较 使用Medcalc软件对3种方法学进行AUC比较，结果显示，ECLIA、CLIA法诊断梅毒的AUC面积均大于ELISA法，差异具有统计学意义(均P<0.05)，CLIA、ECLIA诊断梅毒的AUC差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 三种方法学AUC面积比较

2.6 假阳性、假阴性样本临床特征 ECLIA、CLIA、ELISA法分别有4例、5例、8例检测结果为假阳性，其中3例标本三种方法检测均为假阳性。所有假阳性样本中有基础疾病占比高于无基础疾病，年龄≥50岁占比高于<50岁，见表5。ECLIA、CLIA检测样本均无假阴性样本，ELISA法假阴性样本2例，均为男性，其中一例为再生障碍性贫血，另一例为一期梅毒。

表5 三种方法学检测假阳性标本临床特征分析

3 讨论

以往研究表明，梅毒螺旋体免疫印迹试验(TP-WB)诊断灵敏度、特异性均较高，早期潜伏期梅毒、Ⅱ期梅毒、神经梅毒的阳性诊断率达100%[5]，是梅毒诊断的“金标准”，但由于其操作复杂，影响因素众多，临床开展较少，故本次实验采用TPPA作为梅毒特异性抗体检测的金标准。Park[2]等对不同临床分期的梅毒患者分别采用5种检测方法进行梅毒特异性抗体检测，证实除荧光螺旋体抗体吸收实验(FTA-ABS)外，其余4种检测方法敏感性均高于95.00%，FTA-ABS敏感性显著低于TPPA。Ji[6]采用多中心研究比较CLIA、ELISA法检测梅毒特异性抗体差异，认为CLIA特异性较高，万泰ELISA检测试剂盒敏感性最高。但暂未发现不同方法学S/CO相关性和检测梅毒特异性抗体最佳截断值的相关报道。

贺锋等[7]研究认为雅培化学发光磁微粒免疫分析(CMIA)法S/CO>6.01或科美CLIA法S/CO>9.01时，阳性预测值均为100.00%。本研究发现，随着S/CO增加，三种方法检测的真阳性率逐渐增加，当ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7时，不同方法学检测的样本均为真阳性。通过相关性分析发现，ECLIA法、CLIA法S/CO R2值均明显高于ELISA与ECLIA法、ELISA与CLIA法，结果产生的原因可能与ECLIA、CLIA法均为自动化仪器，批间检测变异度较小，而本研究ELISA为手工法，不同检测批次间变异度偏大有关。在梅毒筛查实验中，诊断试剂特异性偏低可导致假阳性结果，可能会由于错误的梅毒诊断而给患者带来精神负担。而诊断试剂灵敏度偏低则可导致假阴性结果，造成一定程度的漏诊，影响患者的早期诊断和早期治疗[2]。Chen等[8]比较了两种化学发光仪器检测梅毒螺旋体特异性抗体效能，发现两种化学发光检测方法均存在一定程度的漏诊和误诊。Xia等[9]研究发现，罗氏ECLIA、雅培CMIA、迈瑞CLIA检测梅毒特异性抗体敏感度均为100.00%，与本研究相符。本研究亦发现三种方法与TPPA检测结果均为高度一致，ECLIA法、CLIA法、ELISA法Kappa值分别为0.933、0.917、0.833，ECLIA法、CLIA检测灵敏度较高，所有TP样本均成功检出，ELISA法有2例样本漏检，患者均为男性，其中一例为再生障碍性贫血，另一例为一期梅毒。再生障碍性贫血患者存在一定程度的体液免疫抑制和细胞免疫亢进，加上临床常采用免疫抑制的治疗手段，导致ELISA检测假阴性。三种检测方法均存在一定的假阳性，后续通过病历资料的调查发现，此类患者大部分有基础性疾病，如痛风、恶性肿瘤等。王欣俞等[10]研究认为可能与患者血清中一些干扰因素，如类风湿因子、异嗜性抗体、补体、自身抗体等有关。高楠等[11]通过ROC曲线分析比较了8种ELISA试剂检测梅毒特异性抗体的差异，发现所有试剂S/CO最佳截断值均高于厂家推荐值，更高于实验室设定工作S/CO值。本研究亦证实，ECLIA、CLIA、ELISA最佳S/CO截断值分别为1.90、2.20、2.30，均高于厂商推荐值，可能因厂商通过降低S/CO值提高试剂检测的灵敏度，减少漏检。ECLIA法、CLIA法诊断梅毒的AUC均大于ELISA法，说明其诊断效能高于ELISA法。在梅毒临床诊断中，可以优化检测流程，对于ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7标本无需进一步进行TPPA的检测，以节约医疗资源，对于ECLIA法S/CO<5或CLIA法S/CO<7或ELISA法S/CO<7标本必须经TPPA复检，结合临床疾病特征后予以确诊。本研究纳入样本数偏少，可能导致统计结果出现偏差，ROC曲线分析时折点明显，另本研究中ELISA法均为手工操作，可能会导致不同检测批次间对照孔OD值出现一定波动。

综上所述，三种梅毒特异性抗体检测方法均有较高的灵敏度和特异性，与TPPA检测结果具有高度一致性，ECLIA、CLIA法诊断效能高于ELISA法。所有的检测方法都具有其特殊的应用范围，只运用单一的试剂诊断有很大的局限性，存在一定误诊和漏诊。临床工作中，梅毒的诊断需综合血清学、病史、临床表现等加以判断，尽可能减少误诊、漏诊。