攀西矿区典型重金属污染土壤化学-微生物联合修复技术探索

2021-10-12邓敏程蓉舒荣波徐璐李超代力

矿产综合利用 2021年4期

邓敏,程蓉,舒荣波,徐璐,李超,代力

（中国地质科学院矿产综合利用研究所, 矿山生态调查修复室, 四川成都 610041）

攀西地区是我国重要的成矿带，矿产资源丰富，其区域土壤背景值偏高[1-2]。持续多年的高强度矿产开采导致部分地区出现较为严重的土壤重金属污染问题[3-4]。多项调查研究表明，攀西地区部分矿产集中开采区周边土壤中铅、锌、镉、铬等重要环境健康指标出现污染情况，对该区域生态环境质量、粮食安全、人体健康造成了潜在威胁[5-6]。针对土壤重金属污染问题，目前一般采用物理修复、化学修复与生物修复技术。物理修复工程浩大，成本较高，难以大规模应用[7]。化学修复是一种比较成熟的土壤重金属污染修复技术，其中有机络合成本低、见效快，目前主要用于农田土壤重金属络合钝化，但也存在二次污染的问题[8-9]。生物修复成本低、绿色无污染，是土壤重金属修复的重点发展方向，并且以微生物为核心的多种修复方法联合使用将受到越来越多的重视[10]。

微生物稳定，同时辅以化学络合是目前重金属钝化的研究热点[11-12]。适宜的化学络合剂不仅可络合稳定重金属，还可以供给微生物生长，在稳定土壤重金属的同时，还解决了化学修复的二次污染问题，具有广阔的应用前景[13]。目前主流的络合剂有柠檬酸、草酸、丙酸等，主要用于重金属钝化材料以及强化植物萃取剂的制备[9]。可用于稳定化的微生物也有很多，其中又以硫酸盐还原菌（(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)为代表，SRB是一类能通过异化作用进行硫酸盐还原的细菌，其生存、适应能力较强，目前SRB已广泛应用于重金属废水（电镀废水、矿山酸性废水）以及重金属沉积物处理[14-15]，但迄今为止，将SRB应用于土壤重金属修复的研究还鲜有报道。

因此本研究以SRB为修复微生物，以有机酸类为络合剂，开展了SRB筛选及生长特征考察实验、化学络合实验和化学-微生物联合修复实验，综合探索了化学络合-微生物稳定联合修复技术体系应用的可能性，希望开发出具有成本低、效率高、绿色安全等优点的化学-微生物联合修复技术，为解决攀西地区土壤重金属污染问题提供有参考价值的基础研究。

1 实验

1.1 实验材料

1.1.1 供试土壤

供试土壤采自于攀枝花某地，剔除杂质、风干，磨细并过尼龙筛，备用。土壤理化性质见表1。

表1 土壤基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

1.1.2 实验试剂

本次研究所用的试剂均为分析纯（AR），包括无水硫酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铵、硫酸亚铁铵（六水）、氯化钠、丙酸钠、酵母膏、丙三醇、丁二酸钠、乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖、正丁醇、草酸、柠檬酸、苹果酸、丙酸、丁二酸、乙酸、氯化镉、氯化铅等。

1.1.3 供试SRB纯菌菌种

本试验过程中采用的纯种细菌为脱硫弧菌脱硫亚种（Desulfovibriodesulfuricans subsp.desulfuricans）由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，购买编号为1.3469。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物筛选参照杜刚[16]研究，SRB富集培养基配方见表2。

表2 SRB的富集培养基配方(1 L)Table 2 Enrichment medium formulation of SRB

1.2.2 硫酸盐还原菌对镉、铅钝化还原效果分析

配置SRB液体培养基加入CdCl2/PbCl2，用NaOH调pH值为7.0，分别将纯菌和混合菌接种至液体培养基，然后置于厌氧培养箱中培养，观察混合菌对Cd2+、Pb2+的钝化还原情况，并检测Cd2+、Pb2+的浓度，分析其去除率。

去除率=(C初-C末)/C初× 100%

式中：C初为溶液中Cd2+/Pb2+初试浓度，mg/L。

C末为钝化还原后溶液中Cd2+/Pb2+浓度，mg/L。

1.2.3 SRB对化学络合剂的利用效果分析

参照毛在砂[17]的研究，在保证总含碳数一致的标准下，选取12种碳源：乳酸钠、柠檬酸三钠、乙酸钠、丙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、酒石酸钠、丙三醇、正丁醇、葡萄糖、柠檬酸、苹果酸。通过测定FeS生成量来分析SRB对不同底物的利用状况[18]。本次实验培养基培养环境为pH=7.0、T=30 ℃，除碳源外，其他营养物质参照表2配置。

1.2.4 化学络合剂对土壤重金属的络合效果分析

选取上述微生物碳源，分别以液固比1:20、1:100、1:200、1:300(其中“液”指化学络合剂，单位mL；“固”指土壤，单位：g，下同)加入土壤[19]。待土壤稳定后，分别检测土壤重金属镉、铅形态特征变化，重金属形态采用Tessier[20]五步萃取法测定，对照为未作处理的土壤，记为CK。

1.2.5 化学-微生物联合修复对土壤重金属稳定化效果分析

先将络合剂以用1:300和1:200的液固比[19]施入土壤中，再将SRB接入土壤，然后置于厌氧培养箱中培养，待土壤稳定后，分析铅、镉形态变化以及土壤肥效变化，肥效参数测定参照《土壤农化分析》[21]进行，对照样与1.2.4使用的保持一致，同样记为CK。

2 实验结果

2.1 硫酸盐还原菌筛选

在四川某一排污井取污泥样，进行选择性培养，获得一株混合型SRB。该混合菌生长过程中的代谢产物硫化氢(H2S)与培养基中的亚铁离子（Fe2+）结合生成硫化亚铁沉淀(FeS)，连续10次以上10%接种液体培养，所得菌种培养液在培养3 d后，使用血球计数板计数，菌液浓度均可达到1.827×1010个/mL，菌种生长稳定。

2.2 硫酸盐还原菌混合菌基本生长特征

图1为该混合菌的基本生长特征。

图1 混合菌生长特征曲线Fig. 1 Growth characteristic curve of mixed bacteria

从图1中可以看出，该混合菌的生长迟缓期较短(在8 h以内)，此后进入对数生长期，在48 h后进入稳定期，最大OD600值为0.777。培养过程中pH值变化呈现先减少再逐步缓慢增加的趋势。

2.3 硫酸盐还原菌纯菌基本生长特征

为对比研究该混合菌的基本生长特征，购买纯种厌氧细菌进行实验。

从图2看出，该纯菌的生长迟缓期较短，在8 h以内，此后进入对数生长期，在60 h后进入稳定期，最大OD600值为0.344，由此可见，该株纯菌的总体生长代谢速率低于混合菌。培养过程中pH值变化同样呈现先减小再逐步缓慢增加的趋势。

图2 纯菌生长特征曲线Fig. 2 Growth characteristic curve of pure bacteria

2.4 硫酸盐还原菌混合菌对镉、铅去除效果

混合菌对Cd2+的钝化还原沉淀结果表明，添加菌体后，出现絮状颗粒物或黑色固体，初步猜测为SRB的代谢产物H2S与Cd2+、Pb2+沉淀之后形成的硫化物[22]。几乎所有的反应器覆封口膜破裂，并伴有臭鸡蛋味，初步推算为生成硫化氢气体，且接种量越大的气味越重。对其中的Cd2+、Pb2+的浓度进行分析，见表3。

表3 SRB混合菌对Cd2+、Pb2+去除效果Table 3 Removal efficiency of Cd2+ and Pb2+ by SRB mixed bacteria

从表3看出，SRB混合菌对初始浓度为15mg/L和52 mg/L的含Cd2+、Pb2+溶液均有一定的效果，但不同的Cd2+、Pb2+浓度沉淀效果存在差异：在15和52 mg/L条件下，SRB钝化还原168 h后，对镉的去除率分别为94.8%和15.4%，对铅的去除率分别为93.9%和42.3%，表明SRB混合菌对低浓度(15mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果较好，但对高浓度(50mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果不理想，这可能是因为在高浓度Cd2+、Pb2+条件下，SRB易受到毒害作用，导致钝化还原效率降低。

2.5 硫酸盐还原菌纯菌对镉、铅去除效果

为了验证SRB对镉、铅的钝化还原效果，进一步选用纯菌考察SRB对镉、铅的还原效果，实验结果见表4。

表4 SRB纯菌对Cd2+去除效果Table 4 Removal efficiency of Cd2+ by SRB pure bacteria

从表4可发现，随反应时间增加，溶液中的Cd2+、Pb2+逐渐减少，对各浓度Cd2+、Pb2+的还原效果均在187 h处达到最大：187 h时，对10.36 mg/L的Cd2+去除效率达91.6%，52.80 mg/L的Cd2+去除率达83.3%；对9.87 mg/L的Pb2+除效率达90.6%，52.53 mg/L的Pb2+去除率达40.9%，表明SRB对Cd2+、Pb2+确能产生一定的钝化还原效果。

从表4可以发现，SRB纯菌和混合菌对低浓度Cd2+、Pb2+钝化还原效果相差不大，Cd2+、Pb2+两种重金属离子在SRB作用下的去除率也较为一致，结合SRB纯菌和混合菌的生长规律（混合菌的总体生长代谢速率高于纯菌）以及攀西地区污染特征，选定SRB混合菌进行下一步研究。

2.6 硫酸盐还原菌对化学修复剂的利用状况

本次研究拟采用微生物稳定化土壤重金属，同时结合低分子有机酸进一步络合稳定土壤重金属，因此考察了SRB对化学修复剂的利用状况，预期获得既可络合重金属土壤又可作为细菌生产底物的化学络合剂。因此尝试不同的有机物作为络合修复试剂，定量考察FeS的生成量来反映SRB对不同底物的利用状况。不同碳源和不同FeSO4浓度下生成的粗FeS的浓度见表5。

表5 不同碳源下生成的粗FeS的浓度Table 5 Concentration of crude FeS generated under different carbon sources

从表5中可发现，在相同摩尔数不同碳源条件下，丁二酸钠、乳酸钠、正丁醇、柠檬酸、苹果酸、丙酸6种碳源表现出了较好的FeS生成能力，Δ FeS介于5.91 ～ 29.75 g/L，其中柠檬酸和苹果酸表现较优，其Δ FeS分别为29.75、24.91 g/L，其余碳源条件下，SRB生成FeS的能力较差，均低于4.80 g/L。说明SRB对柠檬酸和苹果酸利用率较高，对丁二酸钠、乳酸钠、正丁醇和丙酸利用效果一般，对丙三醇、乙酸钠、葡萄糖、草酸、丁二酸和乙酸利用效果较差。

从FeS的生成量和实际观察来看，SRB对柠檬酸和苹果酸均表现出了较为良好的利用效果，因此选定柠檬酸和苹果酸作为本研究的化学络合剂，并进一步考察其对土壤的络合效果。

2.7 化学络合剂对重金属形态的影响

图4 柠檬酸/苹果酸对土壤中铅形态变化影响Fig. 4 Effects of citric/malic acid on the Pb speciation in soil

化学络合剂对重金属形态的影响见图3、4。从图3、4可以看出，当加入的柠檬酸和苹果酸较少时（液固比为1:300），能对土壤中重金属镉有一定的稳定作用，与对照相比，镉交换态占比最大下降了25.0%，对铅的影响不明显。但随着柠檬酸和苹果酸加入量的增加（液固比大于1:200），土壤pH逐渐降低，镉、铅可交换态增加，与对照相比，镉交换态占比较大增加了107.4%，铅可交换态最大增加了726.9%，重金属被活化。表明低剂量的柠檬酸和苹果酸能对土壤重金属起到一定的络合稳定作用，而高剂量的柠檬酸和苹果酸会对土壤起到酸溶作用，导致重金属被解析。

图3 柠檬酸/苹果酸对土样土壤中镉形态变化影响Fig. 3 Effects of citric/malic acid on the Cd speciation in soil

2.8 化学-微生物联合修复对土壤重金属的钝化效果

化学-微生物联合修复对土壤重金属的稳定化效果见图5、6。

图5 化学-微生物联合修复对土壤中镉形态变化影响Fig. 5 Effects of chemical-microbial combined remediation on Cd speciation in soil

从图5可以看出，化学-微生物联合修复在一定程度上能降低土壤中镉的活性，特别是当以1:300的液固比加入柠檬酸、苹果酸并接入SRB后，镉可交换态有一定程度的降低，有机结合态有一定程度的提高：SRB作修复微生物，柠檬酸或苹果酸作化学络合剂时，镉可交换态占比分别降低了60.7%、38.1%，有机结合态分别提升了23.2%、16.1%；从图6可以看出，在土样中加入柠檬酸或苹果酸并接入SRB后，铅的铁锰结合态占比有一定的降低，残渣态有一定程度的提高，铅的铁锰结合态占比最大降低了25.9%，有机结合态较高占比最大提高了21.8%。实验表明化学-微生物联合修复能使镉、铅朝着更为稳定的形态转变。

图6 化学-微生物联合修复对土壤中铅形态变化影响Fig. 6 Effects of chemical-microbial combined remediation on Pb speciation in soil

此外，从化学络合修复与化学-微生物联合修复实验效果来看，其联合修复效果优于单络合修复，如：与对照相比，络合修复镉交换态占比最大下降了25.0%，而化学-微生物联合修复镉交换态最大降低达到60.7%，对重金属铅（铁锰结合态）也有类似的结果。

2.9 化学-微生物联合修复对土壤肥效的影响

本次研究同时考察了化学-微生物联合修复对土壤肥效的影响，实验结果见表6。

表6 化学-微生物联合修复对土样肥效的影响Table 6 Effects of chemical microbial remediation on soil fertility

从表6中可以看出，仅加入柠檬酸和苹果酸对土壤肥效影响有限：CEC、全氮、碱解氮、速效钾、有效磷含量变化不明显，仅对有机质含量有略微的提升。但在加入有机酸（柠檬酸/苹果酸）和微生物菌液后，土壤肥效有一定程度提高，其中有机质、CEC、全氮、碱解氮、速效钾、有效磷最大分别提高了48.5%、7.5%、18.5%、27.6%、16.1%、65.3%、74.3%。实验表明，仅加入有机酸，对土壤肥效影响不大；加入有机酸和微生物菌液，能在一定程度上提升土壤肥效。

3 分析讨论

SRB(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)是一类能通过异化作用进行硫酸盐还原的细菌，在厌氧/低氧条件时，SRB能通过异化硫酸盐还原作用将SO42-还原为H2S，重金属离子可以和H2S反应生成金属硫化物沉淀，从而将重金属离子沉淀下来，本文中2.4、2.5结果与此拟合，说明SRB确能稳定化重金属。

在土壤中，SRB稳定化重金属一般认为是通过以下三个途径[23]：①SRB通过异化作用将SO42-还原为S2-，进而与土壤中重金属M形成MS，从而稳定化土壤重金属；②硫酸盐还原过程中生成的S2-会使pH升高，降低了土壤酸性，有利于重金属离子生成氢氧化物沉淀；③SRB在代谢过程中分解有机物会产生CO2，重金属离子也可与CO32-反应生成碳酸盐而降低其活性。在本研究中SRB通过这三种途径将土壤中较为活跃的重金属形态转变为更为稳定的重金属硫化物，在一定程度上降低了重金属的迁移性和植物的可利用性。

柠檬酸和苹果酸等低分子机酸能提供配位基团与重金属离子发生酸解络合反应，调节和改变重金属在土壤中的物理化学性质，使其产生沉淀、吸附、离子交换、腐殖化和氧化还原等一系列反应，这种外源物质与土壤中重金属离子结合后，能够改变其在土壤中的迁移性[24-25]。此外，部分络合剂在直接作用于重金属的基础上，还可以作为SRB的有机碳源，促进还原态硫物质的形成，进一步稳定化土壤重金属，从而综合形成化学络合-微生物稳定化处理重金属的协同机制。此外，化学络合-微生物稳定化处理过程中，在土壤中也会添加一定量的外源营养元素，这些营养物质在重金属稳定化处理的过程中对土壤肥效也能起到一定的提升作用。