抗茶轮斑病病原菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)生物农药复配组合筛选

饶家瑞， 周玉锋*， 张金锋， 张 欣， 余用秀

(1.贵州省农业科学院 茶叶研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业科学院 生物技术研究所， 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】茶轮斑病是由拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、新拟盘多毛孢属(Neopestalotiopsis)和假拟盘多毛孢属(Pseudopestalotiopsis)的多种病原引起的茶树叶部病害[1-4]，感病叶片呈褐色不规则圈状大斑[5]。茶轮斑病发生为害严重茶园可导致茶叶大量减产。因此，针对茶轮斑病病原筛选具有抑菌活性的生物农药，对保障茶产业健康绿色发展具有重要意义。【前人研究进展】采用化学农药、生物农药和生防菌对不同地区茶轮斑病的抑制活性研究较多[6-8]。郭世保等[9]研究显示，25%阿米西、10%世高水分散粒剂、25%丙环唑、75%百菌清、50%苯菌灵、70%甲基托布津和80%多菌灵对茶轮斑病均有不同程度的抑菌活性，并以25%阿米西的EC50最佳，为 0.094 7 μg/mL；董照锋[10]研究表明，6%春雷霉素可湿性粉剂、枯草芽孢杆菌和戊唑醇对茶轮斑病的菌丝生长与孢子萌发有较好抑制效果；杨文等[11]研究柠檬醛和香叶醇天然产物对茶轮斑病病原菌(P.theae)抑制活性的结果表明，柠檬醛和香叶醇在500 mg/L浓度下的抑菌活性均高于50%；洪永聪等[12]研究发现，枯草芽孢菌株TL2对茶轮班病的菌丝生长和分生孢子形成均有较好的抑制效果，且其抗菌活性主要是枯草芽孢菌产生的蛋白改变了茶树体内超氧化物歧化酶(SOD)的活性，从而调节茶树活性氧代谢平衡达到限制茶轮斑病扩散的目的。【研究切入点】针对茶园发生的茶轮斑病，筛选复配增效作用明显的生物农药组合用于茶区茶轮斑病的生物防控。【拟解决的关键问题】生物农药具有低毒、可降解优点，对病害防控具有广阔的应用前景[13]。对甲基营养型芽孢杆菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢杆菌和四霉素5种生物农药的抑菌活性进行初筛选，并挑选其中活性较优生物农药进行复配，再采用菌丝速率生长法，测定活性较高生物农药按不同比例复配混合后的抑菌活性及室内毒力强度。以期从中筛选出增效作用明显的配方组合，为茶轮斑病的生物防控和茶产业的绿色健康发展提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶轮斑病病原菌 茶轮斑病病原菌为张欣等[14]于2020年7月从贵州省铜仁市石阡县采集，经单孢分离、结合形态学和系统发育研究，将分离病原鉴定为Pestalotiopsistrachicarpicola，并根据室内回接，验证了其致病性。病原菌由贵州省农业科学院生物技术研究所提供。

1.1.2 药剂 5种生物农药和阳性对照药(CK1)的名称、成分含量、剂型及生产厂家见表1。无水乙醇，购于天津市富宇精细化工有限公司；吐温80，购于天津市大茂化学试剂厂；PDA培养基，购于广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉，购买于成都欧恩瑞思化学试剂有限公司。其他试剂均为化学纯或分析纯，购于上海安耐吉化学试剂有限公司。药品称量，均在Sarfori-us型电子天平(精度0.000 1 g)上完成。

表1 5种生物农药的基本信息

1.1.3 仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，高温蒸汽灭菌锅(上海沉汇仪器有限公司)，BSA224S-CW电子天平，BHC-1300II A/B3生物洁净安全柜，Mill-Q型超纯水制备仪，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液枪等仪器。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

1) 5种生物农药对茶轮斑病的抑菌活性试验。以5种生物农药为试验对象，多抗霉素为阳性对照，吐温80灭菌水为空白对照，共设7个处理，各浓度处理3次重复。根据表1生物农药分别设为5个处理，阳性对照药多抗霉素(CK1)，空白对照等量吐温80灭菌水(CK2)。

2) 抑菌活性较好生物农药复配的联合毒力试验。参照向晓龙等[15-16]的药剂复配设计方法，选取试验1)中抑菌活性较好的中生菌素(A)和四霉素(B)按不同比例进行混合复配，试验共设10个处理，各浓度处理3次重复。处理1，A∶B为9∶1；处理2，A∶B为8∶2；处理3，A∶B为7∶3；处理4，A∶B为6∶4；处理5，A∶B为5∶5；处理6，A∶B为4∶6；处理7，A∶B为3∶7；处理8，A∶B为2∶8；处理9，A∶B为1∶9；处理10，为空白对照等量吐温80灭菌水(CK3)。

1.2.2 不同浓度各生物农药抗茶轮斑病的EC50测定

1) PDA培养基配制。按照购买的PDA培养基使用配方，在3 L清水中依次加入PDA粉120 g、琼脂粉39 g，在搅拌状态下煮沸4 min停火，冷却10 min，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的锥形瓶中封口，在121℃条件下高压灭菌 20 min，冷却备用。

2) 药液配制。将200 μL吐温80加入灭菌后的200 mL灭菌水中，搅拌均匀。分别称取各生物农药5 mg、2.5 mg、1.25 mg、0.675 mg和0.337 5 mg，并分别加入1 mL吐温80灭菌水混匀，现加入4 mL灭菌水，使50 mL PDA培养基中各生物农药的最终浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL，再将含有各待测生物农药的PDA培养基平均倒入3个培养皿中冷却备用。

3) 病原接种。在消毒后的超净工作台上，用打孔器在事先活化好的茶轮斑病菌落边缘打孔，制成直径为4.0 mm的菌饼，然后用无菌接种针将菌饼接种到含有对应生物农药的培养基中，将培养皿放于25℃、80%湿度的恒温培养箱中培养5 d。待空白对照组菌丝生长至6.0 cm左右时，采用十字交叉法测量菌饼直径[11]，用菌丝生长速率法测定各浓度生物农药对茶轮斑病的抑菌活性，筛选抗茶轮斑病活性较高的生物农药。以生物农药浓度的对数为自变量(x)，相对抑制率为因变量(y)，取对数得到生物农药对茶轮斑病的线性回归方程，计算各生物农药的抑制率、抑制中质量浓度EC50及相关系数(R2)。根据EC50判断生物农药的毒力大小。即生物农药的EC50越小，其对茶轮斑病病原菌的毒力越强。

I= [(C-T)/(C-0.4)]× 100%

式中，I为抑制率，C为空白对照的菌丝直径，T为药物处理组菌丝直径。

1.2.3 高活性生物农药复配对P.trachicarpicola的EC50测定 采用菌丝生长速率法[18]，测定中生菌素和四霉素在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL浓度下，按不同比例复配药液对该病原的抑制率，采用1.2.2中公式计算出对应浓度下的抑制率，再对生物农药浓度取对数与其相应抑制率做线性回归方程，从而得出其EC50。

1.2.4 复配药剂的共毒系数 采用菌丝生长速率法测定按不同比例复配混合生物农药的抑菌活性及室内毒力强度。利用SUN等[17]的毒力评判法计算复配农药的共毒系数CTC(co-toxicity coefficient)，并以CTC值评判2种药剂的联合毒力作用。CTC值小于80为拮抗作用，大于120为增效作用，80～120为相加作用。计算公式如下：

1.3 数据处理

采用Excel 2010和DPS 7.05对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 5种生物农药对 P. trachicarpicola的抑制率及毒力强度

2.1.1 不同浓度生物农药对P.trachicarpicola的抑制率 由表2可知，5种生物农药在100～6.75 μg/mL浓度下对P.trachicarpicola的抑制率，均随药剂浓度的减小而降低，且各浓度间差异均达极显著。说明，抑制率和其对应药物的浓度均呈较好线性关系，测定EC50的可信度高。在5种生物农药中，以枯草芽孢杆菌对该病原的抑制率最好，在100～6.75 μg/mL浓度下的抑制率为94.44%～61.42%，比同梯度浓度对照药多抗霉素高27.77～51.23百分点；中生菌素其次，抑制率为95.06%～28.09%，比同梯度浓度对照药多抗霉素高28.39～17.90百分点；甲基营养型芽孢杆菌LW-6第3，抑制率为79.94%～35.19%，比同梯度浓度对照药多抗霉素高13.27～25.00百分点；四霉素与对照药多抗霉素相当；木霉菌在各梯度浓度下的抑制率略低于阳性对照药。

表2 不同浓度下5种生物农药对茶轮斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.1.2 毒力回归方程 从表3可知，通过拟合得到的5种生物农药对茶轮斑病病原(P.trachicarpicola)的毒力方程为y甲基营养型芽孢杆菌LW-6=0.994 7x+3.814 2(R2=0.993 1)，y木霉菌=1.805 7x+1.723 1(R2=0.960 6)，y中生菌素=1.823 5x+2.845 4(R2=0.978 6)，y枯草芽孢杆菌=1.066 2x+4.349 6(R2=0.980 6)，y四霉素=1.290 4x+2.876 3(R2=0.996 4)，y多抗霉素=1.405 8x+ 2.651 6(R2=0.995 6)，相关系数均>0.95，表明5种生物农药及对照药多抗霉素的浓度与抑制率间均存在良好的线性关系。

2.1.3 毒力强度 由表3看出，甲基营养型芽孢杆菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢杆菌和四霉素的EC50分别为15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分别比阳性对照药多抗霉素(46.83 μg/mL)减少用药量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。说明，枯草芽孢杆菌的毒力强度最大，甲基营养型芽孢杆菌LW-6和中生菌素其次，四霉素稍差，且效果均优于对照药多抗霉素。

表3 5种生物农药对茶轮斑病病原(P. trachicarpicola)的毒力回归方程及EC50

2.2 中生菌素和四霉素复配药剂对P. trachicarpicola的抑制率及毒力强度

2.2.1 复配药剂对P.trachicarpicola的抑制率 由表4可知，在100 μg/mL浓度下，9种不同比例复配药剂对P.trachicarpicola的抑制率以处理1最高，为90.97%；处理3次之，为89.58%；处理2第3，为89.24%。处理1除与处理2～5差异不显著外，与处理6～9差异极显著。虽然随着四霉素在复配药剂配方中的占比率增加，对P.trachicarpicola的抑制率呈依次缓慢下降趋势，但仍高于四霉素在100 μg/mL时的抑制率(65.74%)。说明，复配对药剂活性的提升具有一定作用。

表4 5种生物农药(100 μg/mL)对茶轮斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.2.2 复配药剂对P.trachicarpicola的室内毒力强度 从表5可知，A∶B为9∶1复配药剂的抑制活性最佳，EC50为12.03 μg/mL；A∶B为8∶2复配药剂次之，EC50为16.34 μg/mL；随着四霉素在复配药剂中的占比不断增加，复配药剂的EC50呈上升趋势。当A∶B为1∶9时，其EC50达30.95 μg/mL，但仍然低于四霉素单剂EC50的毒力值44.24 μg/mL。9种复配药剂的相关系数均大于0.95，说明复配药剂的浓度与抑制率间均存在良好的线性关系，结果可信。

2.2.3 复配药剂的共毒系数及联合毒力强度 从表5看出，在中生菌素和四霉素复配的9种药剂中，处理1、处理2、处理3和处理4的联合毒力强度为增效，共毒系数依次为310.51、197.82、147.99和134.52；处理5和

表5 中生菌素和四霉素复配药剂的毒力回归方程、EC50、共毒系数及联合毒力

处理6为相加，共毒系数为117.70和97.80；处理7、处理8和处理9为拮抗，共毒系数依次为77.83、63.13和53.76。说明，A∶B=9∶1复配药剂的增效作用最明显，可以尝试用于田间茶轮斑病的生物防控，复配药剂的联合毒力强度整体随四霉素占比增加呈下降趋势，证明中生菌素在复配药剂中的占比对其药剂活性的影响较大。

3 讨论

茶轮斑病可由多种病原菌引起，为针对不同病原有效地进行茶园防控，洪永聪等[12]研究表明，枯草芽孢菌株TL2对茶轮斑病有较好的抑制效果。因此，以茶轮斑病病原(P.trachicarpicola)为目标菌种，用甲基营养型芽孢杆菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢杆菌和四霉素5种生物农药对其EC50进行筛选，选择活性较好的中生菌素和四霉素按照不同比例进行复配，并测试不同配比复配组合的EC50。

甲基营养型芽孢杆菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢杆菌和四霉素5种生物农药在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL浓度下对茶轮斑病病原(P.trachicarpicola)的抑制率均随药剂浓度的减小而降低，且各浓度间差异均达极显著。甲基营养型芽孢杆菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢杆菌和四霉素的EC50分别为15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分别比阳性对照药多抗霉素(46.83 μg/mL)减少用药量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。即5种生物农药的EC50以枯草芽孢杆菌最低，为4.07 μg/mL；中生菌素其次，为15.19 μg/mL；甲基营养型芽孢杆菌LW-6第3，为15.56 μg/mL。

中生菌素和四霉素复配药剂在100 μg/mL浓度下对P.trachicarpicola的抑菌活性测定结果显示，9种复配药剂组合中，以中生菌素∶四霉素为9∶1药剂对茶轮斑病病原菌的抑制率最高，为90.97%；中生菌素∶四霉素为7∶3次之，为89.58%；中生菌素∶四霉素为8∶2第3，为89.24%。虽然随着四霉素在复配药剂组合中的占比率增加，其对茶轮斑病病原菌的抑制率呈依次缓慢降低趋势，但仍然高于四霉素在100 μg/mL时对P.trachicarpicola的抑制率(65.74%)。说明，复配组合对药剂活性的提升具有一定作用。

根据SUN等[17]的毒力评判方法计算复配组合的共毒系数(CTC)。以CTC值评判中生菌素和四霉素2种药剂的联合毒力作用，CTC<80为拮抗作用，CTC>120为增效作用，CTC为80～120为相加作用。9种不同复配药剂的EC50测定结果表明，中生菌素∶四霉素为9∶1复配组合药剂对P.trachicarpicola的抑制活性最佳，EC50为12.03 μg/mL；中生菌素︰四霉素为8∶2其次，EC50为16.34 μg/mL；中生菌素∶四霉素为7∶3第3，EC50为19.25 μg/mL。中生菌素∶四霉素为(9～6)∶(1～4)复配药剂的联合毒力均大于120，表现为药剂增效，并以中生菌素∶四霉素为9∶1的联合毒力最大，为310.51，表现出较好的药剂增效作用。

4 结论

研究结果表明，中生菌素∶四霉素为9∶1复配组合的EC50(12.03 μg/mL)均低于单一中生菌素(15.19 μg/mL)和四霉素(44.24 μg/mL)，其共毒系数为310.51>120，具有增效作用，但还应进一步在田间开展药效试验进行评价。因此，筛选对茶轮斑病抑制效果明显的复配生物农药组合，对茶园减施化学农药用量、降低农药残留和提高茶叶产量和品质具有重要意义。