高通量测序平台研究非小细胞肺癌热点基因突变情况分析

于丽丽

黑龙江省佳木斯市中心医院检验科 154001

肺癌是当今发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，已成为多国的严重公共卫生问题之一。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)为肺癌的主要类型之一，包括大细胞癌、腺癌、鳞癌等，占肺癌总发病人数的80%左右[1]。肺癌的治疗手段比较多样，包括放疗、化疗、手术等，但是由于各种因素的影响，很多患者在被确诊时已是晚期，失去了手术根治的可能，且生存率一直较低[2-3]。同时目前非小细胞肺癌的诊断方法包括组织细胞检查、病理活检、影像学检查、纤维支气管镜检查等，但都存在一定的不足[4]。随着医学技术的发展，基因检测技术得到了广泛应用，该技术是通过应用灵敏的基因技术，检测体液中与疾病发生、发展高度相关的基因突变与表达情况，为疾病的筛查、早期诊治与预后评估等方面提供无创性的方法。特别是当前临床上，居民对于深度测序和高通量测序等大规模测序的需求越来越迫切，高通量测序平台的应用也比较普遍[5]。高通量测序平台也称为第二代测序技术，测序样本量小，可分析几十万条核酸序列，测量效率高[6]。当前有研究发现肺癌患者存在多个基因的突变，这可能也是导致肺癌患者治疗效果、临床特征以及预后生存存在一定差异的原因[7]。本文具体分析了高通量测序平台研究非小细胞肺癌热点基因突变情况，以促进非小细胞肺癌的早期检出。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年11月—2020年11月在本院肿瘤科诊治的非小细胞肺癌患者110例作为肺癌组，同期选择健康体检者110例作为对照组。纳入标准：本院伦理委员会批准了此次研究；所有入选者均自愿参加实验，并已签署知情同意书；年龄20～80岁；具有完整的临床或体检资料；肺癌组经组织学和/或细胞学确诊为非小细胞肺癌；肺癌组为初治患者，有可测量的病灶；肺癌组采集样品前没有进行任何治疗；肺癌组预期生存期≥3个月。排除标准：妊娠或哺乳期女性；合并多个部位肿瘤者；伴有严重肺纤维化的患者；伴有严重内科疾患或严重感染者。

两组入选者的性别、年龄、心率、血压(收缩压/舒张压)、生活行为(吸烟/饮酒)、体重指数等对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。在肺癌组中，病理分型：大细胞癌23例，腺癌47例，鳞癌40例；临床分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期44例，Ⅲ期30例；组织学分化：低分化44例，中分化34例，高分化32例；淋巴结转移38例。

表1 两组一般资料对比

1.2 外周血采集及血浆分离 采集所有患者清晨空腹静脉血2～3ml，采用EDTA抗凝管收集，静置于常温(18～35℃)保存，于2h内分离并冻存血浆。2 000r/min离心5min，取上清血浆组织，在-80℃冰箱保存。

1.3 基因突变检测 采用QIAamp Mini blood Kit(德国Qiagen公司)提取所有血浆样本的DNA，严格按照说明书进行操作。通过NCBI primer在线引物设计工具进行多重PCR引物设计，利用Illumina高通量测序平台进行双端测序，对测得的原始碱基数、原始序列数、碱基质量进行统计，去掉短小序列。建立整个样本处理后所有序列和去重复后的唯一序列，根据两组的基因表达水平，利用软件筛选出显著差异表达的基因，要求差异倍数≥3，重点分析基因突变主要参与的生化代谢通路和信号转导通路。采用实时荧光定量PCR验证KRAS、PIK3CA、TP53基因突变情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.00软件对本研究所有数据进行分析，计量数据以均数±标准差表示，行t检验，计数数据以百分比表示，行χ2检验分析，检验水准为α=0.05。P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA质量参数对比 两组所有入选者DNA提取体积>40μl，浓度>1ng/μl，总量>55ng，<200nt比例<5%，都符合质控要求，两组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组DNA质量参数对比

2.2 基因表达中差异 两组筛选出显著差异表达的基因共1 245个，其中肺癌组表达上调652个，表达下调593个。

2.3 KRAS、PIK3CA、TP53表达差异情况 基因测序与实时荧光定量PCR显示肺癌组的KRAS、PIK3CA、TP53表达水平都高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组KRAS、PIK3CA、TP53表达差异情况对比

2.4 KRAS、PIK3CA、TP53基因突变情况对比 基因测序显示肺癌组的KRAS、PIK3CA、TP53基因突变率分别为30.0%、22.7%、17.3%，高于对照组的3.6%、1.8%和0.9%(P<0.05)。见表4。

表4 两组KRAS、PIK3CA、TP53基因突变情况对比[n(%)]

3 讨论

当前肺癌的发病率一直处于高位，不仅严重影响了患者的生命质量，也给国家、社会、家庭带来沉重经济负担。非小细胞肺癌占肺癌的80%以上，约80%以上的患者确诊时已是晚期。早期非小细胞肺癌的5年生存率在80%以上，而晚期非小细胞肺癌的5年生存率在20%以上，因此尽早识别肺癌，提高诊断率，是改善患者预后的关键[8]。

不过很多非小细胞肺癌患者的临床表现不特异，影像学检查显示为良性结节，而进行病理检查对患者有一定的创伤性。因此临床上需要一种操作便捷、检测准确度高、便于早期诊断、无创、经济的检测手段，使非小细胞肺癌的早期检测能够方便可行[9]。肿瘤分子标记物检测具有简便快捷、创伤小的优势，已被用于非小细胞肺癌的辅助诊断、病情判断和预后预测中[10]。特别是随着高通量测序技术、生物信息学的发展，极大地推动了肺癌分子标记物的发展。本研究显示两组所有入选者DNA提取体积>40μl，浓度>1ng/μl，总量>55ng，<200nt比例<5%，都符合质控要求，两组对比差异无统计学意义(P>0.05)；两组筛选出显著差异表达的基因共1 245个，其中肺癌组表达上调652个，表达下调593个。从机制上分析，当前高通量测序平台所需要的样本量只需≥10ng即可建库，而生物信息学可利用数学工具从大量数据中提取有用信息，从而探索非小细胞肺癌患者的发展规律[11]。特别是与Sanger测序法一样，高通量测序平台也为一种直接测序法，可发现所分析序列上的所有突变类型，例如微卫星改变、基因突变、异质性缺失、启动子过甲基化等[12]。当前多数中晚期非小细胞肺癌患者失去了手术的机会，只能采取以铂类为基础的化疗方案，但其有效率维持在30%左右，中位生存时间不到12个月。与此同时，第二代测序技术的出现，现如今在临床上已有一些医院与医生将高通量测序平台应用于对肿瘤的研究[13]。本研究的基因测序与实时荧光定量PCR显示肺癌组的KRAS、PIK3CA、TP53表达水平都高于对照组(P<0.05)；基因测序显示肺癌组的KRAS、PIK3CA、TP53基因突变率均高于对照组(P<0.05)。从机制上分析，KRAS是原癌基因RAS家族的成员之一，编码KRAS4a和KRAS4b蛋白，KRAS突变可使得MAPK处于过度活化状态，促进恶性肿瘤细胞增殖与抑制肿瘤细胞凋亡[14]。PIK3CA是编码Ⅰ类磷脂酰肌醇信号通路的重要基因之一，在肺癌发展中起重要作用，可促进细胞增殖、转移与分化，导致细胞癌变。多数肿瘤组织存在TP53基因的突变，后者可能是肿瘤发生发展的重要危险因素；特别是TP53基因突变使其空间构象发生了改变，使其失去了对细胞增殖、凋亡和DNA修复的调控，有利于肿瘤的增殖[15]。本研究也存在一定的不足，样本量有限，可能存在一定的抽样误差，同时没有进行多基因突变类型分析，仍有待后续大样本深入分析。

总之，高通量测序平台能有效检出非小细胞肺癌热点基因突变情况，具有很好的应用可行性，值得推广应用。