促进结肠癌细胞铁坏死增强其对顺铂敏感性的机制研究*

范智敏 刘礼剑 王正根

1 南华大学附属第二医院消化内科，湖南省衡阳市 421001； 2 湖南省汉寿县人民医院内镜室； 3 广西中医药大学第一附属医院

在我国，结直肠癌在癌症相关死因中已跃居第三位，成为男性第三大常见肿瘤和女性第二大常见肿瘤[1]。顺铂是用于治疗实体瘤的最有效和广泛使用的抗癌剂之一。不幸的是，许多癌症最初对顺铂有反应，但随后肿瘤复发常难以进行铂类治疗，导致耐药的发生[2]。因此，增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性成为热点。

JAK蛋白家族是一类非受体型酪氨酸激酶，分4个亚型，STAT家族是其下游信号蛋白， STAT3作为JAK/STAT信号通路的重要成员，主要参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程。研究发现[3]用小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474(ZactimamTM,Vandetanib) 能够抑制p-STAT3 的表达，并诱导伊马替尼耐药细胞凋亡。 因此，STAT3与肿瘤细胞的耐药性有着密不可分的关系。

研究发现，铁死亡诱导剂能够增强化疗药物(如替莫唑胺、顺铂、阿糖胞苷/阿拉伯糖和多柔比星/阿霉素)在某些癌细胞中的有效性。例如，索拉非尼是第一种用于全身治疗晚期肝细胞癌的药物，其机制是通过诱导这些肿瘤细胞发生铁死亡从而抑制肿瘤细胞的增殖。青蒿琥酯最近也被证明可通过诱导铁和ROS依赖性细胞死亡抑制人胰腺癌和卵巢癌细胞的增殖[4]。因此，推测铁死亡可能在调节顺铂敏感性和耐药性中发挥关键作用。本研究中评估了铁坏死在结肠癌细胞对顺铂敏感性的作用及其涉及的机制，阐明了结肠癌细胞顺铂耐药性发展的新分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 0.25%Trypsin-EDTA购自美国Gibco公司，DMEM培养基、CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物公司、胰蛋白酶购自上海仁捷生物公司，青霉素、链霉素、阿霉素购自美国Sigma公司，顺铂购于江苏豪森公司。

1.2 细胞培养条件和耐药细胞株HT29/DDP、SW480/DDP的建立

1.2.1 细胞培养条件：结肠癌细胞株SW480及HT-29购自赛百慷(上海)生物技术有限公司，在实验室10%胎牛血清细胞培养基中进行培养，选择融合度达到90%以上的细胞进行实验[5]。

1.2.2 药物诱导耐药：采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法来诱导HT29、SW480细胞的顺铂耐药。使用不同浓度顺铂处理对数生长期的HT29、SW480细胞，镜下观察后选出HT29、SW480对顺铂的最低耐受浓度。用质量浓度为1μg/ml的顺铂与进入对数生长期的HT29、SW480细胞共同培养24h后，更换不含顺铂的培养液，待细胞稳定生长后传代，重复上述步骤5次后将顺铂浓度更换为2μg/ml，继续重复上述操作5次，再更换为5μg/ml的顺铂处理细胞3次。直至HT29、SW480细胞在5 μg/ml浓度下稳定生长和传代，表明耐药诱导成功，同时将该诱导细胞命名为HT29/DDP、SW480/DDP[6]。

1.2.3 CCK法测细胞活力：将结肠癌细胞以2×104/ml的密度接种于96孔培养板，每组设置3个复孔。对照组加入与模型组细胞加药量等体积的DMSO溶液后，培养0h、12h、24h、48h、72h。接着在每孔中加入10μl的CCK-8溶液，培养箱孵育1h后用酶标仪测出其光密度值D(450nm)，进行统计分析[2]。

1.2.4 细胞活性氧水平测定： 2’，7’-二氯二氢氟醚(DCFH-DA)探针本身是无荧光的，但其在进入细胞内后可水解成2’，7’-二氯二氢荧光素(DCFH)。水解后形成的DCFH能够被活性氧氧化成高荧光的二氯荧光素(DCF)，可作为细胞内活性氧生成的检测指标。将细胞分别置于96孔板中，在培养箱37℃孵育30min后尽快洗涤细胞降低背景后进行ROS检测。

1.2.5 丙二醛(MDA)检测：本文采用硫代巴比妥酸比色法来检测MDA水平。原理为：过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸结合，形成红色复合物，该复合物在532nm处有最大吸收峰。

1.2.6 Western blot：提取细胞蛋白，蛋白定量后进行制胶、SDS-PAGE 凝胶电泳并电转移至硝酸纤维素膜，接着使用5%的脱脂奶粉封闭2h，洗膜后一抗(1∶1 000)封闭过夜，二抗(1∶2 000)孵育 2h，最后加 ECL 显影。GAPDH作为内参照。根据(目的蛋白净面积值)/(GAPDH净面积值)计算出各目的蛋白的相对含量(%)。

2 结果

2.1 结肠癌细胞对顺铂耐药与STAT3信号通路增强有关 为了研究结肠癌细胞的顺铂耐药是否与STAT3信号通路有关，首先用25%的顺铂连续培养得到顺铂耐药结肠癌细胞HT29/DDP、SW480/DDP。接着通过Western Blot检测顺铂耐药株与敏感株的STAT3通路相关蛋白的表达。结果显示：与敏感株相比, 耐药株的p-STAT3(Ser727)、Nrf2、GPx4蛋白表达增加；提示在耐药株中STAT3信号通路增强。并且，在这里发现GPX4蛋白表达增加，提示耐药株铁死亡受到抑制，由此猜测结肠癌的顺铂耐药与STAT3信号通路的增强从而抑制癌细胞铁坏死有关(图1)。

图1 顺铂处理后的HT29细胞及SW480细胞

2.2 结肠癌细胞耐药与铁死亡受到抑制有关 为了证实结肠癌细胞的顺铂耐药与铁死亡受到抑制有关，接着检测了结肠癌细胞的细胞活力以及 ROS、MDA水平。结果显示：与敏感株+顺铂组相比，耐药株+顺铂干预组的细胞活力增强(图2)。而ROS和MDA水平下降(图3)，提示该组铁死亡处于抑制状态。

图2 顺铂处理后的HT29及SW480细胞活力

图3 顺铂处理后的HT29及SW480细胞ROS

2.3 促进铁死亡可以增加结肠癌细胞对顺铂的敏感性 为了进一步验证：促进铁死亡可以增加结肠癌细胞对顺铂的敏感性，使用了铁死亡激活剂Erastin和RSL3联合顺铂来处理HT29/DDP、SW480/DDP细胞，接着分别统计了结肠癌细胞0h、12h、24h、48h、72h的细胞活力。结果显示：铁死亡诱导组(Erastin, RSL3组)的细胞活力明显低于耐药组，其中处理时间为48h时差异最明显(图4)； 并且铁死亡诱导组的MDA、ROS的水平均明显增加(图5)。以上结果共同表明，促进结肠癌细胞的铁死亡可以增加其对顺铂的敏感性。

图4 Erastin和RSL3处理的HT29以及SW480细胞后细胞活力

图5 Erastin和RSL3处理的HT29以及SW480细胞后ROS

2.4 抑制STAT3信号通路逆转了顺铂诱导的铁坏死抑制 接着为了确定结肠癌细胞对顺铂耐药与STAT3信号通路的增强有关，在使用顺铂的基础上使用了STAT3信号抑制剂处理HT29/DDP、SW480/DDP细胞。结果显示：STAT3抑制剂组的细胞活力相较于耐药组与顺铂处理组而言是降低的(图6)；MDA、ROS的水平均明显增加(图7)，提示铁死亡增加； WB结果显示抑制剂能使Nrf2、GPx4表达量增加 (图8)，说明STAT3信号通路受到明显抑制，而促进铁死亡。以上结果表明：抑制STAT3信号通路逆转了顺铂诱导的铁坏死抑制，促进药物对顺铂的敏感性。

图8 STAT3的抑制增加HT29及SW480细胞Nrf2、GPx4的表达

3 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重危害人类健康，其发病率在发达的欧美国家仅次于肺癌。在我国，随着饮食习惯、生活方式及环境因素等的变化，结肠癌发病率呈明显上升趋势[2]。化疗是目前结肠癌患者的主要治疗手段之一，主要为铂类药物，但伴随铂类药物的广泛使用，结肠癌细胞对顺铂类药物逐渐出现耐药的现象，并且这也是目前化疗失败的最常见原因之一[4]。 因此，探索新型的高效低毒的靶向抗癌药物对结肠癌的药物治疗显得尤其重要。

图6 STAT3的抑制降低HT29以及SW480细胞的细胞活力

图7 STAT3的抑制增加HT29以及SW480细胞的ROS和MDA

信号传导与转录激活子是介导细胞信号传导的转录因子家族，具有传递胞质信号和启动核内基因转录的双重功能，其中STAT3与肿瘤的发生、发展及预后相关。近年来研究证明，STAT3信号通路的异常激活可介导肿瘤细胞对化疗药物耐药，成为评价病情及预后的指标之一[3]。本文的研究也证实了在耐药株中STAT3信号通路是处于异常激活的状态，说明了结肠癌细胞的顺铂耐药与STAT3信号通路的异常激活状态确实有关，证实了STAT3在肿瘤耐药中的重要作用。

2012年，Stockwell小组确定了铁死亡：一种新型的受调节细胞死亡。它是铁依赖性和过氧化驱动的非凋亡性程序性细胞死亡模式，其特征在于致死的脂质活性氧(ROS)的积累[7]。脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通过限制脂质氢过氧化物水平，而被认为是铁蛋白沉积症的负调控因子[8]。研究已经证实了在各种肿瘤细胞中存在铁死亡，如纤维肉瘤、肺癌、骨肉瘤、肾癌和前列腺癌细胞[9-12]。尽管铁死亡与人类疾病有关，但其精确的调节机制和生物学功能仍然难以琢磨。与此研究相一致的是：本研究结果显示耐药菌株的铁死亡水平低于对照组，并且呈现出细胞活力增强，ROS和MDA降低，GPx4蛋白表达水平降低的现象，验证了结肠癌细胞的细胞活力受抑制是因为铁死亡处于抑制状态的原因。为了进一步验证：在耐药株加入顺铂的同时分别使用了铁死亡诱导剂Erastin、RSL3处理结肠癌细胞，结果表明，使用了铁死亡诱导剂的结肠癌细胞组的细胞活力下降伴随着铁死亡的增加，说明促进结肠癌细胞的铁坏死能抑制结肠癌细胞的细胞活力。证实了铁死亡在结肠癌细胞耐药中的重要作用。

为了更好地验证STAT3是否与铁死亡有关，在对结肠癌细胞使用顺铂之后加入了STAT3抑制剂。并且检测了铁死亡相关蛋白与细胞活力等，结果发现细胞活力下降，铁死亡水平增加，表明了STAT3的抑制会增强结肠癌细胞的铁死亡，从而缓解癌细胞的耐药，在这个过程中，虽然STAT3激活可能是由不同途径诱导的，但我们的研究结果强调STAT3抑制可以降低结肠癌细胞的细胞活力，增加结肠癌细胞的铁死亡。

综上所述，促进结肠癌细胞的铁坏死能够增强其对顺铂的敏感性，为临床上结肠癌的治疗提供了新的思路。