全球产KPC肺炎克雷伯菌的KPC分布与序列分型分析*

朱宏，沈瀚，曹小利，刘畅

(南京大学附属鼓楼医院检验科，南京210008)

随着碳青霉烯类药物的使用，碳青霉烯耐药肠杆科细菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae, CRE)不断出现和播散，导致发病率和死亡率增高，是全球面临的严峻公共卫生问题[1]。流行病学研究表明，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)约占CRE的60%[2]。已知碳青霉烯水解酶KPC的产生是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯耐药的主要机制[3]。在欧美国家，ST258是CRKP常见的流行克隆[4];在亚太地区，ST11是CRKP常见的流行克隆[3]。本研究旨在分析全球产KPC肺炎克雷伯菌的序列分型，并分析主要流行克隆与KPC-2、KPC-3间的关系。

1 材料和方法

1.1菌株 使用Aspera软件从NCBI中下载2018年12月31日前提交释放的肺炎克雷伯菌基因组，剔除重复提交、没有注释的菌株，共计5 494菌株。

1.2KPC基因的分布 采用本地blastp工具进行比对分析：用5 494个基因组的所有蛋白质编码核苷酸序列比对NCBI上提供的40个KPC的核苷酸序列[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/isolates#/refgene/gene_family:(blaKPC)]，以蛋白质相似度>80%为阈值，分析KPC在5 494株肺炎克雷伯菌中的分布。

1.3多位点序列分型 (multilocus sequencing typing，MLST) 通过下载7个管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB的基因序列，构建多位点序列分析(multi locus sequence analysis，MLSA)数据库。利用本地BLASTN技术，将产KPC菌株基因组中所有编码蛋白质的核苷酸序列与MLSA数据库进行比对，以确定菌株的序列分型(sequence types, STs)。然后通过比较MLSA曲线来确认每个菌株的ST。

1.4统计学分析 用SPSS软件(20.0版本)进行。用皮尔逊卡方检验分析KPC-2、KPC-3在不同ST克隆间的流行率差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1碳青霉烯耐药基因KPC的分布 5 494株肺炎克雷伯菌中，1 943株(35.4%)细菌携带14个KPC变异体。其中，以KPC-2(959/1 943，49.4%)和KPC-3(952/1 943,49.0%)为主，其余KPC-4、KPC-16、KPC-31、KPC-12、KPC-32、KPC-4、KPC-6、KPC-7、KPC-8、KPC-27、KPC-33和KPC-34占比均低于0.4%。

2.2携带KPC基因肺炎克雷伯菌株的ST 1 943株产KPC菌株共有115个ST，其中，996株为ST258(占51.3%)，285株为ST11(占14.7%)，259株为ST512(占13.3%)，其余ST型别占比均低于2.3%，有9株细菌为新的ST(目前的数据库中没有对应的ST)。

2.3KPC-2和KPC-3肺炎克雷伯菌中的ST分布 959株KPC-2肺炎克雷伯菌分布在87个ST菌株中，其中，413株为ST258(占43.1%)，274株为ST11(占28.6%)，其余ST型别占比均低于4.2%，有6株细菌为新的ST。952株KPC-3菌株分布在45个ST中，以ST258(570/952,59.9%)和ST512 (259/952,27.2%)为主，其余型别占比均小于2.1%，有3株细菌为新的ST。

KPC-2和KPC-3的主要流行克隆型见表1。

表1 KPC-2和KPC-3肺炎克雷伯菌的主要序列分型分布

2.4主要克隆菌株间携带KPC-2、KPC-3基因的情况 285株ST11携带的KPC变异体为KPC-2(n=274)、KPC-3(n=6)、KPC-12(n=3)、KPC-16(n=1)、KPC-44(n=1)。996株ST258携带的KPC变异体为KPC-2(n=413)、KPC-3(n=570)、KPC-12(n=1)、KPC-16(n=1)、KPC-31(n=1)、KPC-32(n=1)、KPC-34(n=1)、KPC-44(n=1)、KPC-7(n=1)、KPC-8(n=1)。259株ST512携带的KPC变异体均为KPC-3。 KPC-2在ST11中的分布(274/285，96.1%)显著高于在ST258中的分布(414/996，41.6%)，差异有统计学意义(χ2=43.819，P=0.000)；KPC-3在ST512中的分布(259/259，100%)显著高于在ST258中的分布(570/996，57.2%)，差异有统计学意义(χ2=206.645，P=0.000)。

3 讨论

本研究在NCBI中检索到40个KPC的变异体，分别从肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等多株细菌分离。然而通过分析这40个KPC变异体在5 494株细菌中的分布，只发现14个KPC变异体，这种差异可能与KPC的流行有关，因为在全球范围内，KPC-2、KPC-3是介导肺炎克雷伯菌对碳青霉烯耐药的主要流行酶[5]。在中国，KPC的流行以KPC-2为主[6]，而在欧美等国家，同时有KPC-2和KPC-3的流行播散[7]。此外，KPC-3分布在45个ST中，而KPC-2分布在87个ST中，表明KPC-2似乎有更广泛的宿主菌。

MLST分析发现，1 943株产KPC菌株有155个ST，表明了该类菌株的遗传多样性。不过，本研究发现的ST11、ST258和ST512是产KPC肺炎克雷伯菌的主要克隆，这与国内外的报道一致[8]。目前已知，这3个克隆都属于克隆组258，属于国际高危流行克隆[9]，是医疗卫生机构重点监测的超级耐药菌。此外，ST258携带着最多的KPC变异体，其次为ST11，而ST512只携带KPC-3酶，这可能意味着ST258与编码KPC变异体的质粒之间有很好的宿主适应性。另外，本研究发现，虽然KPC-2在ST11中的分布显著高于其在ST258中的分布，KPC-3在ST512中的分布显著高于其在ST258中的分布，但ST258的流行与KPC-2和KPC-3分布没有差异，这种流行分布趋于一致的情况，暗示ST258作为国际高危流行克隆，可能与KPC-2和KPC-3的分布密切相关，也表明肺炎克雷伯菌特定克隆ST258在KPC播散中的优势，具体机制有待于进一步阐明。

总之，从全球范围来看，KPC的流行以KPC-2和KPC-3为主，KPC-2的流行克隆菌株以ST11和ST258为主，KPC-3的流行克隆菌株以ST258和ST512为主，加强该类细菌的监测对于院内感染控制具有重要的作用。