库德毕赤酵母FJZ固态发酵产乙酸乙酯工艺的优化

韩 英，李惠源，贾丽艳，甄 攀，高文静，王军艳

（1.山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西汾阳 032209；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801；3.山西省白酒生物工程研究生教育创新中心，山西太谷 030801）

传统清香型白酒是以高粱为原料，大曲为发酵剂，通过网罗环境中的微生物，采用“清蒸二次清，地缸固态发酵，甑桶蒸馏”工艺生产而成，具有“入口绵，落口甜，清香不冲鼻，饮后有余香”的特点[1]，在国内外深受消费者的喜爱。乙酸乙酯是清香型白酒的主要风味物质之一，其在白酒中的含量及与其他风味物质的比例，对于清香型白酒的风格具有重要影响[2]。由于自然环境对清香型白酒中乙酸乙酯的形成具有一定的影响，使得乙酸乙酯在清香型白酒中的含量及比例具有一定的不稳定性，影响清香型白酒的品质[3]。微生物是白酒发酵的核心。从自然环境中分离高产乙酸乙酯的菌株，并强化应用于清香型白酒的生产中，对于稳定清香型白酒中乙酸乙酯含量，提升清香型白酒品质具有一定的意义。

山西杏花村是以汾酒为代表的传统清香型白酒的主产地，具有悠久的酿造历史[4]，自然环境中存在优良的微生物菌种资源。为了挖掘山西杏花村本土环境中的功能性微生物，课题组从2015 年开始从杏花村汾酒厂分离筛选传统清香型白酒酒醅及生产环境中的功能性菌株，期间，从传统清香型白酒的酒醅中分离筛选获得1 株高产乙酸乙酯的菌株，经鉴定为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），命名为库德毕赤酵母FJZ。该菌株具有良好的生物学特性和环境耐受性[5]，具有应用于传统清香型白酒发酵生产的潜能。为此，课题组在前期研究的基础上，以高粱为发酵基质，采用固态发酵技术，以乙酸乙酯和总酯含量为检测指标，通过单因素及响应面试验优化发酵工艺，确定库德毕赤酵母FJZ 固态发酵产乙酸乙酯发酵工艺条件，为该菌株在白酒酿造过程中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌株

库德毕赤酵母FJZ（简称菌株FJZ）：分离自山西杏花村汾酒厂新鲜酒醅中。

1.1.2 培养基

YEPD液体培养基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L。固体培养基加20 g琼脂[6]。

发酵用高粱固态培养基：将1 L 去离子水加入到500 g 粉碎后的高粱中浸泡24 h，再经过滤后蒸煮2 h，晾凉至60 ℃后，加入适量糖化酶，消化2 h，制成固态发酵培养基，灭菌备用[7]。

1.1.3 试剂及耗材

蛋白 胨，葡 萄糖，CaCl2，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，酵母膏，琼脂，糖化酶(3000 U/g)，液化酶(20000 U/g)，乙酸乙酯（分析纯），以上试剂均购买于北京索莱宝公司。

1.1.4 仪器设备

PR-CJT-4 超净工作台，上海普瑞斯仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GNP-9160 电热恒温培养箱，上海精宏试验设备有限公司；BS2010S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；TopPette移液枪，济南东仪试验室设备有限公司；85-2A 磁力搅拌器，精凿科技（上海）有限公司；pHSJ-4A pH计，美国奥立龙公司；DL-1 万用电炉，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素试验的设计

（1）发酵温度对菌株FJZ产酯能力影响的测定

将菌株FJZ 以3.0%接种量接入发酵用高粱固态培养基中，分别在24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃和36 ℃条件下发酵7 d，测定其总酯和乙酸乙酯含量，探究发酵温度对菌株FJZ产酯能力的影响。

（2）发酵时间对菌株FJZ产酯能力影响的测定

将菌株FJZ 以3.0%接种量接入发酵用高粱固态培养基中，30 ℃分别发酵5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，测定其总酯和乙酸乙酯含量，探究发酵时间对菌株FJZ产酯能力的影响。

（3）接种量对菌株FJZ产酯能力影响的测定

将菌株FJZ 分别以3%、5%、7%、9%和11%的接种量接入发酵用高粱固态培养基中，30 ℃条件下发酵7 d，测定其总酯和乙酸乙酯含量，探究接种量对菌株FJZ产酯能力的影响。

（4）辅料添加量对产酯能力影响的测定

将菌株FJZ 以3.0%接种量接入发酵用高粱固态培养基中，分别按12%、14%、16%、18%和20%的比例加入谷糠，30 ℃条件下发酵7 d，测定其总酯和乙酸乙酯含量，探究辅料添加量对菌株FJZ产酯能力的影响

1.2.2 响应面试验设计

根据单因素试验确定影响产酯能力的显著因素，以总酯和乙酸乙酯含量作为响应值设计响应面试验，获得最优发酵工艺条件。

1.2.3 理化指标的测定

（1）总酯含量的测定：采用碱皂化回流法[8]。

（2）乙酸乙酯含量的测定：参考魏志阳[9]的方法测定样品中乙酸乙酯含量，对样品前处理方法略作修改，即称取50.00 g样品于烧杯中，加入300 mL体积分数为10%乙醇浸泡0.5 h，期间，每隔10 min 搅拌1 次，过滤，滤渣再用体积分数为10%的乙醇反复清洗过滤，定容至1000 mL，获得液相检测用品，备用。

1.2.4 数据的处理

利用Origin8.5 软件和Design Expert 10 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对菌株FJZ产酯能力的影响（图1）

图1 发酵温度对产酯能力的影响

由图1 可知，随着发酵温度的升高，库德毕赤酵母FJZ 的产酯能力也发生相应的变化，酯类浓度呈先上升后下降的趋势，且乙酸乙酯与总酯含量变化趋势一致，呈正相关性。当温度在24～30 ℃范围内时，乙酸乙酯及总酯含量逐渐上升；当培养温度在30 ℃时，总酯及乙酸乙酯含量都达到了最大值，分别为（7.98±0.17）g/100 g 和（1.38±0.021）g/kg；当发酵温度在30 ℃以上时，乙酸乙酯及酯类含量呈下降趋势。以上结果表明，菌株FJZ 在30 ℃时产酯能力最佳，高温对菌株FJZ 产乙酸乙酯能力具有抑制作用。因此，菌株FJZ 固态发酵产乙酸乙酯的最佳发酵温度为30 ℃。

2.2 发酵时间对菌株FJZ产酯能力影响（图2）

由图2 可知，随着发酵时间的延长，酯类浓度呈先上升后缓慢下降的趋势。当发酵时间为7 d时，总酯含量和乙酸乙酯含量都达到最大值，分别为（7.02±0.02）g/100 g 和（1.35±0.013）g/kg，酒醅中总酯及乙酸乙酯含量增加了3 g/100 g 和1.08 g/kg，分别提高了75%和400%。因此，菌株FJZ 固态发酵产乙酸乙酯的最佳发酵时间为7 d。

图2 发酵时间对产酯能力的影响

2.3 接种量对菌株FJZ产酯能力影响（图3）

图3 接种量对产酯能力的影响

接种量对高粱培养基中菌株发酵周期有很大影响，接种量过低会使菌株生长缓慢，导致代谢速率低，产酯能力不足[10]。而接种量过高，过量的菌株生长所消耗的底物过多，造成产酯所需的营养物质严重不足，导致菌株产酯能力下降，使酯类浓度降低。由图3可知，随着接种量的变化，菌株FJZ在高粱培养基中的酯类浓度呈现先上升后下降的趋势。当接种量为3%时，总酯和乙酸乙酯浓度都达到最大值，分别为（8.24±0.07）g/100 g 和（1.33±0.01）g/kg，分别比空白对照组提高了104%和850%；当接种量大于3%时，总酯含量呈现缓慢下降的趋势。因此，菌株FJZ 固态发酵产乙酸乙酯的最佳接种量为3%。

2.4 辅料添加量对菌株FJZ产酯能力影响（图4）

图4 辅料添加量对产酯能力的影响

白酒固态发酵中，辅料的填充，赋予酒醅一定的疏松度，使得酒醅中具有微量的氧气，这有利于好氧或兼性厌氧微生物的生长，促进香味成分的生成；然而，辅料用量过大，透气性过好，也会导致酒醅升温和生酸过快，影响发酵和风味物质的形成[11-12]。由图4 可知，随着辅料添加量的增加，乙酸乙酯及酯类含量呈先上升后下降的趋势。当辅料添加量为4%时，总酯和乙酸乙酯含量都达到最大值，分别为（8.11±0.08）g/100 g 和（1.28±0.014）g/kg。因此，菌株FJZ 固态发酵产乙酸乙酯的最佳辅料添加量为4%。

通过对菌株FJZ 的发酵温度、发酵时间、接种量、辅料添加量进行单因素水平试验，探究各因素水平对产乙酸乙酯能力以及总酯含量的影响，结果表明，发酵温度、发酵时间、接种量、辅料添加量对于酒醅中总酯和乙酸乙酯的形成具有一定的影响。

2.5 响应面法试验结果及方差分析

通过单因素试验，筛选出4 个影响总酯和乙酸乙酯变化的显著因子，为进一步优化工艺，对发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）、辅料添加量（D）4 个因素进行优化试验设计（表1），结果见表2。

表1 响应面分析的因素水平

表2 响应面试验设计与结果

对应用Design Expert 8.0.6.1 软件设计的响应面试验结果进行多元化回归拟合分析，得出该菌株固态发酵的总酯含量（Y1）与发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）、辅料添加量（D）四因素变量的二次方程模型为：

Y1=8.11-0.31*A-0.19*B-0.27*C-0.45*D-0.37*A*C+0.17*A*D+0.07*B*C+0.043*B*D +0.25*C*D-1.32*A2-1.15*B2-0.37*C2-0.48*D2。

乙酸乙酯含量（Y2）与A、B、C、D四因素的二次方程为：

Y2=1.26+0.019*A-0.072B+0.11*C+0.067*D+0.060*AB-0.065*AC+0.023*AD+5.000E-003*BC-0.013*BD+0.050*CD-0.14*A2-0.20*B2-0.27C2-0.19*D2。

根据表3 方差分析可知，回归模型P 模型＜0.0001＜0.01，表明该响应面回归模型差异极显著。失拟项P=0.0502/0.0523＞0.05，差异不显著，说明试验误差较小，模型预测结果可靠。回归方程R2=0.9931/0.9986，表明四因素与总酯和乙酸乙酯含量之间的多元回归关系显著，试验设计的可靠性极佳，因此，可以利用该回归方程预测上述因素对菌株FJZ 产酯工艺的优化。由方差分析结果可知，接种量A，发酵温度B，接种量C，辅料添加量D 对高粱固态培养基中总酯含量和乙酸乙酯含量的影响都极显著。

表3 响应面试验方差分析

2.6 发酵条件验证试验

根据响应面试验结果，最终确定菌株FJZ 最佳产酯发酵条件为：发酵时间6.92 d、发酵温度29.67 ℃、接种量3.08%、辅料添加量3.89%。根据实际情况，对预测最佳工艺参数进行微调，最终实际工艺参数为发酵时间7 d，发酵温度30 ℃，接种量3%，辅料添加量4%，为验证模型预测的工艺参数可靠性，在此条件下进行验证试验，以传统清香型白酒正常发酵酒醅为对照，重复3 组平行试验，测得高粱固态发酵培养基中总酯含量和乙酸乙酯含量分别为（8.13±0.08）g/100 g 和（1.30±0.014）g/kg，实际数值与模型预测数值基本一致，故该模型基本准确。

传统清香型白酒大米查、二米查各发酵28 d 酒醅中的乙酸乙酯含量在0.3～0.5 g/kg 之间，而利用以上模型，菌株FJZ 所产乙酸乙酯可以达到（1.30±0.014）g/kg，生成量约为传统清香型白酒发酵酒醅中乙酸乙酯的2.5～4 倍，以上结果表明，菌株FJZ具有提升传统清香型白酒中乙酸乙酯含量的能力。

3 结论

菌株FJZ 高粱固态发酵产乙酸乙酯最佳工艺条件为：发酵温度30 ℃，发酵时间7 d，接种比例3%，辅料添加量4%。该条件下高粱固态发酵培养基中总酯含量可达（8.13±0.08）g/100 g，乙酸乙酯含量达（1.30±0.014）g/kg，在高粱中产乙酸乙酯能力强。菌株FJZ 具有强化应用于传统清香型白酒生产中提升乙酸乙酯含量的能力。以上研究为菌株FJZ 在白酒及其他酿造类食品中的开发利用奠定了理论和应用基础。