胎盘绒毛组织中金属蛋白酶及血管内皮生长因子表达与复发性流产的关系

柳栾美 张天如 郭金霞 洛阳北方企业集团有限公司职工医院妇产科，河南省洛阳市 471000

复发性流产指连续发生≥2次的自然流产，是育龄女性生育失败的主要原因，严重者会导致不孕不育，对女性身心健康造成不良影响[1]。相关研究显示，复发性流产的发生率占总妊娠女性的1%～5%，占早期流产病例的30%～40%[2]。复发性流产的病因目前尚未明确，已有研究报道的包括生殖器异常、免疫功能异常、遗传、环境因素、胎儿染色体异常[3]。研究者发现，基质金属蛋白酶(MMPs)家族参与调节滋养细胞浸润和胎盘的发育过程[4]；血管内皮生长因子(VEGF)能够促进孕早期胎盘绒毛组织中血管的生成[5]。本文探讨了MMP-2、MMP-9及VEGF在复发性流产患者胎盘绒毛组织中的表达特点，旨在为阐明MMPs、VEGF与复发性流产的关系提供参考。

1 对象与方法

1.1 观察对象 选取2018年3月—2019年10月间本院收治的复发性流产患者42例为观察组。入选标准：(1)连续性流产≥2次；(2)染色体检查正常，孕周≤12周，临床资料完整。排除标准：(1)有复发性流产家族史的患者；(2)生殖系统异常的患者。年龄23～38岁，平均年龄(29.40±2.72)岁；妊娠天数57～74d，平均妊娠(63.08±10.35)d。收集同期自愿终止妊娠的孕早期流产者39例为对照组，年龄20～37岁，平均年龄(28.71±3.05)岁；妊娠天数56～76d，平均妊娠(63.71±9.95)d。性别、年龄在两组患者间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者自愿参与并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与HE染色。两组孕妇均行负压吸引流产术终止妊娠，术中收集胎盘绒毛组织标本，平均成两份，将其中一份标本放入液氮中速冻后转移至-80℃保存用于RT-PCR检测；另一份标本在4%多聚甲醛溶液中固定后常规石蜡包埋，4μm连续切片，行HE染色，光学显微镜下观察两组孕妇胎盘绒毛组织的形态结构。

1.2.2 胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA水平检测。Trizol法提取胎盘绒毛组织标本总RNA，逆转录得到cDNA，用于RT-PCR反应模板。反应体系共20μl：上、下游引物各1μl、cDNA 1μl、Sybr Green荧光染料10μl、双蒸馏水7μl。引物序列由上海泽叶生物科技有限公司设计合成，MMP-2上游引物5’-GTGTGTGTCTACCATCCTCGCA-3’，下游引物5’-GTGTCTG TCTGCGTAATCTTA-3’；MMP-9上游引物5’-CCCTTGTAGGCCAGGTGG-3’，下游引物5’-CCTCCTCACCTCCACCCG-3’；VEGF上游引物5’-GTCGTCTTTCAA GT ACCTAGGT-3’，下游引物5’-ACACTGTTCGGTTCCGCCACT-3’。反应条件：95℃ 10min，95℃ 2min，56℃ 40s，共40个循环，延伸72℃ 2min。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH为内参计算MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA的相对表达量。

1.2.3 胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白水平检测。取胎盘绒毛组织石蜡切片，常规脱蜡至水，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，高温、高压修复抗原。滴加鼠抗人MMP-2、MMP-9单克隆抗体，均为1∶500稀释，兔抗人VEGF单克隆抗体(1∶300稀释)，4℃过夜，次日滴加二抗：羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，均为1∶1 000稀释，室温反应1h，DAB显色、苏木素复染，切片脱水、透明后封片，倒置显微镜下观察并拍照，Image pro plus 6.0进行定量分析，使用积分光密度(IOD)表示MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达水平。

2 结果

2.1 两组胎盘绒毛组织形态结构比较 对照组胎盘绒毛形态规则，滋养细胞内外层结构完整、排列整齐，绒毛间质无水肿。观察组胎盘绒毛形态不规则，滋养细胞外层萎缩融合、数量减少，内层异常增多、排列紊乱，绒毛内血管发育不良、间质水肿，血细胞总量减少，存在少量炎性细胞。见图1。

图1 两组胎盘绒毛组织形态结构观察(HE，×200)

2.2 两组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA和蛋白表达水平比较 观察组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2。

表1 两组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表达水平比较

图2 两组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白免疫组化染色(SP ×200)

2.3 观察组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9、VEGF表达的相关性分析 Pearson相关性分析显示，观察组胎盘绒毛组织中VEGF与MMP-2、MMP-9表达呈负相关(r=-0.695，P=0.000；r=-0.682，P=0.000)；MMP-2与MMP-9表达呈正相关(r=0.631，P=0.000)。

3 讨论

复发性流产是常见的妊娠期并发症，孕12周之前发生为早期复发性流产，孕12～28周发生为晚期复发性流产，是不孕不育的主要原因之一，严重影响女性身心健康[6]。复发性流产的病因繁多，包括遗传因素、免疫应答异常、胚胎发育不良等，具体机制仍未明确。近年研究认为，孕期胎盘绒毛组织血管形成障碍、入侵蜕膜细胞滋养层是复发性流产的主要原因[7]。本文胎盘绒毛组织HE染色结果提示，复发性流产患者胚胎绒毛血管发育不良，滋养细胞分化水平异常导致滋养层厚度变薄，胎盘功能不全可能是复发流产的原因。

金属蛋白酶是一类依赖锌离子、钙离子等金属离子发挥催化活性的蛋白水解酶，能够降解胞外基质。相关研究显示，金属蛋白酶与血管生成和侵袭性疾病的发生有关，能介导子宫内膜异位症、恶性肿瘤的发生与发展[8]。其中MMP-2、MMP-9是孕早期滋养细胞进入子宫内膜的主要活性酶。孕早期绒毛外滋养细胞分泌MMP-2、MMP-9，降解胞外基质中Ⅳ型、Ⅴ型胶原蛋白，为滋养细胞进入子宫内膜创造条件，确保妊娠持续。VEGF是促内皮细胞分裂原，能促进血管形成。孕期母体与胚胎的营养交换基础为胎盘绒毛组织血管新生。研究发现，复发性流产患者子宫内膜组织中VEGF存在低表达，可能与孕早期自然流产的发生密切相关[9]。

本文结果显示，观察组胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组。可推测胎盘绒毛组织中MMP-2、MMP-9表达上调可能诱发滋养细胞对母体子宫蜕膜基质的过度降解，导致胎盘未发育完全时即从宫腔中提前脱离，导致复发性流产；VEGF表达下调会影响胚胎绒毛血管的正常生理功能，降低母体对胚胎的营养供应，与复发性流产存在关联。相关性分析显示，观察组患者VEGF与MMP-2、MMP-9表达呈负相关，MMP-2与MMP-9表达呈正相关。提示VEGF与MMP-2、MMP-9可能共同参与了复发性流产的发生与发展，具体分子机制仍需进一步深入研究。