Mstn 在淇河鲫的表达研究

张一帆，冯世坤

（河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

Mstn，即肌肉生长抑制素（myostain），又称生长分化因子-8（growth and differentiationfactor 8，gdf8），是TGF-β超家族的成员，对骨骼肌生长发育有着负向调节作用[1]。同时具有调节糖代谢和脂代谢的功能，参与胚胎发育的调控和动物体内各组织平衡[2]。有研究表明，mstn可在哺乳动物，如人，小鼠，牛等的卵巢中表达。Cheewasopit[3]等发现牛卵巢中的mstn可促进颗粒细胞Cyp19a1的表达和雌二醇的产生。雌激素具有加速卵巢生长的作用，因而mstn可能对性腺分化发育有影响。然而在硬骨鱼类中尚未见mstn对卵巢分化发育作用相关的报道。

由于鱼类相对特殊的基因复制，很多硬骨鱼类的mstn基因包含两个亚型，即mstn1和mstn2。有研究表明淇河鲫两种mstn基因在许多组织中均有表达[4]。其中mstn1主要在肌肉和大脑中表达，而mstn2主要在大脑中表达。但Mstn蛋白在组织细胞中定位的研究较为匮乏。为了明确淇河鲫Mstn蛋白在组织中的细胞定位，特别是不同时期卵巢组织中的表达情况。本研究采集淇河鲫的脑、鳃、脾、肝、肠、肾、头肾，红肌和白肌，通过半定量PCR检测mstn基因的mRNA在淇河鲫各组织表达水平；采用免疫组化的方式进行Mstn基因的细胞定位。从而对mstn在组织中的表达情况进行阐述，进而探究mstn是否具有除刺激肌肉发育以外的作用。

淇河鲫（Carassius auratus in Qihe river) 属鲤形目（Cypriniformes) 鲤科（Cyprinidae) 鲤亚科（Cyprinidae)，原产于河南省北部的淇河，因而称之为淇河鲫，是河南省农产品地理标志。淇河鲫是天然的三倍体鱼类，具有两性生殖和雌核发育两种繁殖方式。通过异源精子刺激，进行雌核发育，可产生全雌性个体[5]。这为我们进行卵巢各时期mstn鉴定奠定基础。在自然界中淇河鲫的生长速度快，其背脊厚度是普通鲫鱼的2倍，出肉率也高于普通鲫鱼、日本白鲫和方正鲫，其肌肉中蛋白质含量为18.43%～19.51%，高于黄河鲤（18.19%～18.45%）。同时含有较高谷氨酸，因而味道鲜美，具有极大的发展前景。迄今为止，mstn在硬骨鱼类卵巢分化发育的方面的研究较少。本研究以淇河鲫为实验模型，通过检测Mstn在淇河鲫卵巢各时期的表达情况及其细胞定位，探究Mstn对淇河鲫卵巢分化发育的影响，以此来为之后鱼类该基因的功能研究提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取河南师范大学水产养殖基地的淇河鲫作为实验材料。养殖采用带有循环曝气淡水养殖系统的大型养殖池。环境温度保持在24℃左右，光照周期为14 h光照、10 h黑暗。在繁殖季节将雌性淇河鲫与雄性鲤鱼按8：1的比例放入亲鱼池，人工诱导产卵。受精卵在23℃的环境下孵育，直至发育成幼鱼。孵化期间定期观察胚胎发育情况。所有动物实验均符合《实验室动物护理和使用指南》。通过MS-222溶液浸泡对鱼进行麻醉，尽量降低实验过程鱼中受到的痛苦。

1.2 总RNA提取和cDNA第一链的合成

用MS-222试剂麻醉淇河鲫，剖取脑、鳃、心脏、头肾、脾、肝、肠、肾、红肌、白肌，每个组织各取三个独立样本，迅速放入液氮中冷冻，后在-80℃中保存。同样方法取不同发育时期的卵巢组织。用TaKaRa RNAiso Plus（TaKaRa，大连）试剂盒提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否被污染，条带是否完整。分光光度计检测RNA OD值及RNA浓度。选取A260/A280为1.8～2.0的样品进行后续实验。采用Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（含gDNA Eraser）（TaKaRa，大连）合成cDNA第一链。

1.3 半定量PCR、实时定量PCR和统计分析

采用半定量PCR的方法测定mstn基因在淇河鲫各组织中的表达情况。以β-actin作为内参，进行半定量PCR。采用实时定量PCR的方法检测mstn基因在淇河鲫卵巢的表达情况，计算不同组织相对表达量，用SPSS软件分析差异的显著性，结果用平均值±标准误（mean±SE）的方式进行表示，显著水平为P<0.05。

1.4 Mstn蛋白的组织分布

为了进行组织分布分析，取健康淇河鲫成鱼组织，如脑、鳃、脾、肝、肠、肾等。并采集30、40、60 dah等不同发育时期的卵巢组织。室温环境下，在超净台内解剖，波恩氏液固定过夜。脱水透明后，石蜡包埋切片，片厚5 μm。石蜡切片脱蜡，复水处理后，用一级抗体和二级抗体孵育，苏木精染色，梯度酒精脱水后，中性树胶封片。显微镜观察组织形态结构是否完整，是否具有阳性信号，并用显微镜采集分析系统镜鉴，拍照保存以待分析。卵巢中淇河鲫Mstn的免疫定位用作阳性对照，而正常兔血清用作阴性对照。

2 结果

2.1 Mstn基因在淇河鲫各组织中的表达特征

以β-actin作为内参基因，通过半定量PCR测定淇河鲫各组织中mstn基因表达量。结果表明（图1），mstn1在脑，红肌和白肌中表达量高，而mstn2则在脑，肝和红肌中表达量高。两种mstn在肾和头肾中表达较低，在其他组织中几乎检测不到。

图1 淇河鲫不同组织中mstn1和mstn 2 mRNA的表达情况

2.2 Mstn蛋白在淇河鲫不同组织中的细胞定位

为确定Mstn蛋白在淇河鲫不同组织表达的细胞类型，我们进行了免疫组化实验。结果表明，Mstn蛋白阳性信号在各组织中普遍表达（图2）。其中，Mstn在脑中主要表达在放射性胶质细胞，在肠中为肠绒毛上皮细胞，在肾中为肾小管上皮细胞，在头肾中为肾间细胞，在红肌和白肌中均为肌细胞，在肝中为中央静脉与门管区，在脾中为红髓，在卵巢中为间质细胞，在鳃中为支柱细胞。

图2 Mstn在组织中表达情况

2.3 Mstn1和Mstn2在淇河鲫卵巢不同发育时期的表达谱

通过实时定量PCR 的方法检测mstn在淇河鲫卵巢不同发育时期的表达谱。结果表明（图3），在卵巢发育早期mstn基因就已开始表达。其中mstn1在淇河鲫卵巢分化的关键时期（40 dah)急剧上调，随后下调；在卵巢发育关键时期（150 dah)时显著升高（P<0.05)。而mstn2在5到90 dah时呈显著下降趋势，在120，150 dah时逐渐升高，在210，720 dah时减少并保持稳定。

图3 mstn1和mstn2在淇河鲫卵巢不同时期表达量

2.4 Mstn蛋白在淇河鲫不同时期卵巢中的细胞定位

通过免疫组化检测Mstn在淇河鲫在不同时期的卵巢中的表达，结果显示Mstn从30 dah开始在卵巢间质细胞中的表达（图4）。

图4 Mstn在卵巢不同时期表达情况

3 讨论

Mstn基因在哺乳动物中的表达特异性强，一般只在骨骼肌中表达。但是鱼类作为低等脊椎动物，mstn基因的表达出现了多样性。由于鱼类相对特殊的基因复制，很多硬骨鱼类的mstn基因包含两个亚型，即mstn1和mstn2。本研究以淇河鲫为实验模型，检测mstn在其组织分布情况及卵巢不同发育时期的表达谱，同时采用免疫组化的方法进行细胞定位。半定量PCR结果显示mstn1在淇河鲫脑，红肌和白肌中表达量高，而mstn2则在脑，肝和红肌中表达量高，这与我们前期定量PCR检测结果一致[4]。两种mstn在肾和头肾中表达较低，在其他组织中几乎检测不到。有研究表明在其他鱼类，如虹鳟[6]、大马哈鱼[7]等，两种亚型的mstn基因的组织表达分布也不相同。虹鳟[6]的mstn1在肌肉、脑、心脏、肾、肝、肠、鳃及性腺中均有表达，mstn2只在脑和肌肉中表达。大马哈鱼[6]的mstn1在肌肉、脑、肠、鳃、舌、眼、脾和卵巢中表达，mstn2在肌肉、脑、舌、眼鳃中表达。这与我们的研究结果类似。

免疫组化结果显示Mstn蛋白阳性信号在脑部的放射性胶质细胞，肠道的肠绒毛上皮细胞，肾脏的肾小管上皮细胞，头肾的肾间细胞，红肌和白肌的肌细胞，肝脏的中央静脉与门管区，脾脏的红髓，卵巢的间质细胞，鳃的支柱细胞中表达。这两种Mstn蛋白在肌肉中的高表达意味着它在淇河鲫生长方面的关键作用。Mstn2在脑中的显著表达表明其可能在中枢神经系统发育方面有影响。Mstn基因在鱼类体内的广泛分布及不同亚型的不同组织表达结果，意味着它们在淇河鲫生长发育的过程中可能发挥着不同的作用，不仅限于调控肌肉生长。

此外，实时定量PCR对淇河鲫卵巢发育不同时期中mstn基因表达的鉴定表明在卵巢发育早期mstn基因就已经开始表达。Amali[8]等在斑马鱼中发现mstn的表达是母源性的，其在I细胞中就开始表达。本研究的结果表明，在卵巢不同发育时期，两个mstn基因的表达水平也有所不同。在40 dah时期以及发育中后期时，mstn1的表达量较高。而mstn2的表达量则在发育早期较高，即除40 dah的5～60 dah的时期，其余水平均低于mstn1，且在发育后期210、720 dah时显著下降。研究表明，在40 dah时，淇河鲫正处于卵巢分化的关键时期，150到210 dah是淇河鲫卵巢发育的时期，在此期间，mstn1的高表达预示着mstn基因参与淇河鲫卵巢分化及后续的卵巢发育。而mstn2在卵巢早期的高表达可能预示着其对卵巢发育早期具有促进作用。

免疫组化结果显示，在淇河鲫不同发育时期卵巢中Mstn在间质细胞表达。卵巢间质细胞构成卵巢间质区，卵巢间质区为卵泡提供生长和发育的环境。Mstn蛋白在卵巢间质细胞中的高表达可能意味着该基因有维持卵巢环境稳定和刺激卵泡发育的作用。有研究表明，在哺乳动物中Mstn在颗粒细胞中表达，具有促进Cyp19a1表达，雌激素产生的作用[3]。Mstn蛋白也在淇河鲫体细胞及成鱼颗粒细胞中表达，这意味着它可能也会促进cyp19a1合成，进而影响卵巢分化发育。

综上所述，Mstn基因在淇河鲫各组织中普遍表达，这说明其可能参与淇河鲫生长发育各个阶段，不仅仅局限于肌肉生长。且它在卵巢各时期的表达研究也表明该基因具有影响卵巢分化发育的作用。这为探究mstn基因在卵巢发育过程中的调控提供了一定的基础数据。但其在卵巢中的具体作用还需进一步研究。