云南省部分养殖场鸡传染性贫血病毒核酸检测及VP2 基因序列分析

王 斌，张振兴，宋建领

（1.威信县动物疫病预防控制中心，云南威信 657900；2.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

鸡传染性贫血（chicken infectious anemia，CIA）是由鸡传染性贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）引起雏鸡以贫血和免疫抑制为主要特征的传染病，根据临床症状又称鸡蓝翅病、出血综合征，早期也称为鸡贫血因子（chicken anemia agent，CAA），是危害我国家禽养殖的重要垂直传播疫病之一。该病1979 年在日本被首次发现[1]，1992 年在我国被首次确认发生[2]，现今已在全球范围内蔓延[3-8]。2015 年7 月，该病病原被国际病毒分类协会归分于圆环病毒科。CAV 核酸为环状单股负链DNA，基因组大小为2 298 bp 或2 319 bp，编码 VP1、VP2 和VP3 蛋白。其中，VP2 为非结构蛋白，是CAV 最保守蛋白，因此在分子流行病学检测中VP2基因作为PCR 检测的首选基因。为了解近年来CAV 在云南省养鸡场的流行及其VP2基因变异情况，2017—2020 年在昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区，采集样品进行CAV 核酸检测，并对部分阳性样品进行VP2基因序列分析。

1 材料

1.1 病料

2017—2020 年，在昆明市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区，采集89 个养鸡场的疑似肿瘤疫病病鸡肝脏样品，冷藏送实验室检测。

1.2 主要试剂及仪器

DNA 核酸提取试剂盒、PCR 试剂盒和DL 2 000 DNA Marker 等，均购自大连宝生物公司；超净工作台（型号为LA2-4A1），购自ESCO 公司；PCR 仪（型号为9700），购自美国ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝胶成像系统（型号为2000），购自美国BIO-RAD 公司。

2 方法

2.1 病料处理

将每份肝脏组织样品剪碎，按1:5 的体积比加入灭菌PBS 研磨，将研磨后的混合物反复冻融3 次，3 000 r/min 离心10 min，取上清液提取核酸。

2.2 PCR 检测

按照DNA 核酸提取试剂盒说明书，分别提取上清液的DNA 核酸。根据文献[9]，合成CAV检测引物（CAVF：5'-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3'；CAVR：5'-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-3'），预期扩增产物582 bp。反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃，45 s，52 ℃，50 s，72 ℃，45 s，35 个循环；72 ℃，10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，100 V 电泳30 min，观察PCR 扩增结果。

2.3 VP2 基因扩增和序列分析

将PCR 检测的代表性阳性样品扩增后，按照胶回收试剂盒说明进行DNA 回收。回收的DNA送昆明硕擎生物测序。采用MegAlign 软件，对VP2基因进行序列比对和系统发育分析。

3 结果与分析

3.1 PCR 检测

2017 年1 月—2020 年12 月，在昆明市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市的89 个鸡场共采集422 份样品，检出CAV 核酸阳性245 份，平均阳性率为58.06%。部分阳性样品PCR 产物琼脂糖凝胶结果见图1。不同年份的核酸阳性率为53.61%～60.91%（表1），不同地区的核酸阳性率为51.68%～63.52%（表2），差异均不显著（P＞0.05）。

表1 不同年份病原核酸检测结果

表2 不同地区病原核酸检测结果

图1 CAV 阳性样品PCR 扩增结果

3.2 VP2 基因序列分析

自GenBank 数据库下载国内外已知的CAVVP2基因序列，采用MegAlign 软件进行序列比对和系统发育分析。序列比对及系统发育分析结果（图2）显示：3 份CAV 阳性样品VP2基因核苷酸序列同源性为99.6%～99.8%，与其他参考毒株1852TW和N7 之间的核苷酸同源性为99.6%～99.8%，均属于Group A 分支，与Group C 分支的Australian 毒株同源性为98.2%～98.4%，与Group B 分支毒株的同源性为99.5%～99.6%。

图2 CAV VP2 基因系统进化分析结果

4 讨论

CAV 感染后，是否表现临床症状与鸡的年龄、毒株毒力以及伴发或继发其他疫病等因素有关。该病主要表现为皮肤、喙、肉髯和可视黏膜苍白以及发育迟缓、精神沉郁、消瘦等临床症状，如果仅为单一感染，没有并发和继发其他疫病病原感染，则死亡率较低或表现一过性临床特征。如果继发其他病原感染，则可阻碍病鸡康复，使病死率增高[10]。在血清流行病学调查中发现，该病的死亡率与饲养环境、营养因素等密切相关，饲养环境好、饲料营养佳的鸡场虽检测到CAV 核酸阳性，但临床症状不明显，经济损失也小。李岳等[4]对我国部分地区进行血清流行病学调查发现，13 个省市疑似发病的381 个鸡群中CAV 群阳性率为12.50%～50.00%，普遍存在于调查的 13 个省市中。另外有文献[10]报道，黑龙江、广西和安徽等省区的CAV 核酸阳性率为39.35%。本次检测的云南省CAV 核酸阳性率为58.06%；李珂等[11]在云南省地方品种鸡群4 种垂直传播病毒血清流行病学调查中发现8 个地方品种鸡群的CAV 抗体阳性率为98.47%。上述数据表明，云南省CAV 感染率较高，说明该病防控对于云南省家禽养殖业更为重要。CAV 与马立克病毒（MDV）、禽白血病病毒（ALV）、禽网状内皮组织增殖病毒（REV）等其他免疫抑制性病原双重或三重混合感染率为52.94%[4]。本次检测也发现了CAV 与 MDV、ALV 混合感染病例，表明 CAV 与其他免疫抑制性病毒混合感染现象普遍存在。另外，也有CAV 与新城疫病毒（NV）、禽流感病毒（AIV）混合感染的报道[9]。由于CAV在临床症状和病理变化方面的表现没有MDV、ALV、NDV、AIV 感染明显，因此该病往往被养殖者忽视。

本次检测发现，CAV 阳性样品的VP2基因核苷酸序列同源性为99.6%～99.8%，与其他CAV 毒株VP2基因的核苷酸同源性也在98.2%以上，均属于Group A 分支，与国内流行毒株以Group A 群为主的报道[12-13]一致。因此，在该病毒核酸检测中，VP2基因仍可作为PCR 检测的首选目标基因。通过加强鸡群CAV 监测，淘汰阳性鸡群和结合疫苗免疫，可减少该病造成的损失。