云南省某腹泻仔猪群猪流行性腹泻病毒核酸检测及其N 基因序列分析

张振兴，王 斌，宋建领

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.威信县动物疫病预防控制中心，云南威信 657900）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起仔猪和育肥猪的一种急性接触性肠道传染病，主要表现为呕吐、腹泻、脱水，多发生于哺乳仔猪，对哺乳仔猪具有高致死率[1]。PED 最早发生于1971 年的英国，1978 年比利时人Pensaert 等[2]首次分离鉴定出该病病原。2010 年后变异PEDV 毒株在中国、韩国、日本迅速蔓延，2013 年4 月扩散至美国，造成了严重经济损失，至今仍对全球养猪业危害巨大[3-4]。

PEDV 属于套式病毒目（Ni-dovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）。其基因组核酸为单股正链RNA，基因组长度约为28 kb，编码4 个结构蛋白（S、E、M 和N）和 4 个非结构蛋白（1a、1b、3a 和3b）[5]。N 蛋白是病毒粒子核衣壳的主要成分，通过结合RNA 将病毒基因组RNA 包装到病毒颗粒的核衣壳中，在病毒复制和细胞感染过程中发挥重要作用[6]。

1 猪群腹泻概况

2021 年2 月，云南省曲靖市某种猪场 47 头母猪生产的564 头仔猪出现呕吐、黄色水样腹泻、脱水等临床症状，其中10 日龄仔猪死亡367 头，病死率为65.01%。死亡仔猪剖检变化主要为皮下干燥，胃内有黄白色凝乳块，小肠严重扩张，肠壁内充满气体，并伴有黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿。经临床初步诊断怀疑为PEDV 感染。

2 材料与方法

2.1 病料采集处理

采集3～5 头病死仔猪肠道、肠系膜淋巴结、脾脏等组织病料，混合剪碎研磨，按照体积比1:10加入PBS，反复冻融3 次后，3 000 r/min 离心10 min，取上清液提取核酸。

2.2 核酸提取

按照RNA/DNA 核酸提取试剂盒说明书，提取组织上清液核酸。

2.3 引物合成

根据国内外已发表的PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（RVA）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因序列及相关文献[7-10]，分别设计检测引物，检测引起仔猪腹泻的常见病原核酸。引物序列信息见表1。

表1 病原核酸检测引物序列

2.4 核酸检测

以2.2 提取的核酸为模板，参照一步法RTPCR 试剂盒和PCR 试剂盒说明书，配制反应液。PEDV、TGEV、RVA、CSFV、PRRSV反应液：RNase Free dH2O 6.2 μL、2×1 Step Buffer 10.0 μL、Prime Script 1 step Enzyme Mix 0.8 μL、上游引物（20 μmol/L）0.5 μL、下游引物（20 μmol/L）0.5 μL、模板RNA 2.0 μL。PEDV 反应条件：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性2 min；95 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 10 s，共35 个循环，72 ℃延伸10 min。TGEV、RVA、CSFV、PRRSV 反应条件：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环，72 ℃延伸10 min。PRV 反应液：RNase Free dH2O 7.0 μL、rTaqBuffer 10.0 μL、上游引物（20 μmol/L）0.5 μL、下游引物（20 μmol/L）0.5 μL、模 板DNA 2.0 μL；PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察。

2.5 N 基因序列分析

将RT-PCR 检测的PEDV 阳性样品，用PEDV引物按如下反应体系扩增样品N基因：RNase Free dH2O 16.0 μL、2×1 Step Buffer 25.0 μL、Prime Script 1 step Enzyme Mix 2.0 μL、上游引物（20 μmol/L）1.0 μL、下游引物（20 μmol/L）1.0 μL、模板RNA 5.0 μL。RT-PCR 反应条件同病原核酸检测条件。扩增产物按TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 胶回收试剂盒说明书进行DNA 回收。回收的DNA 送昆明硕擎生物进行测序，采用MegAlign 软件，对N基因进行序列比对和系统发育分析。

3 结果与分析

3.1 病原核酸检测

在采集的肠道、肠系膜淋巴结、脾脏等组织器官样品中检出PEDV 核酸阳性（图1），而RVA、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV 核酸检测均为阴性（图2～3）。

图1 样品PEDV PCR 扩增结果

图2 样品RVA、TGEV PCR 扩增结果

图3 样品PRRSV、CSFV、PRV PCR 扩增结果

3.2 N 基因序列分析

通过BLAST 比较后，自GenBank 数据库中下载国内外公开的PEDVN基因序列和同源性高的PEDVN基因序列，采用Mega 6 软件进行序列比对和系统发育分析。序列比对结果显示：PEDV 阳性样品N基因与河北T10-HB2018 毒株核苷酸同源性最高，为99.7%，与经典毒株CV777 同源性为95.7%，与疫苗株AJ1102 和LW/L 毒株同源性为97.4%～97.5%。系统发育分析结果显示：PEDV 阳性样品N基因与疫苗毒株AJ1102 和LW/L 在同一个分支上，均属于基因II 群（图4～5）。上述结果表明，该猪场感染的PEDV 毒株N基因变异较小，与疫苗毒株同源性较高。

图4 PEDV N 基因核苷酸同源性分析结果

图5 PEDV N 基因系统进化分析结果

4 讨论

PEDV 对猪肠道尤其是哺乳仔猪肠道具有极高的致病性，导致仔猪肠绒毛上皮细胞（以空肠和回肠为主）脱落，引起严重的腹泻和呕吐，继而造成广泛性脱水，使感染仔猪大批量死亡。本病例临床症状和剖检变化都出现了典型的PED 特征，通过RT-PCR 检测和N基因序列分析，确诊该场发病原因为PEDV 感染。针对病因采取疫苗紧急免疫和对症治疗，获得了比较理想的治疗效果，免疫后猪群再次出生的仔猪，发病率降低5%左右。仔猪腹泻仍是现代养猪业主要疫病症候群之一，导致仔猪死亡率高，阻碍其生长发育，降低饲料利用率，给养殖户造成巨大经济损失。但是仔猪腹泻病因复杂，除了常见的细菌病、病毒病、寄生虫病等传染因素外，还与猪场的管理、水质、饲料等因素密切相关。为了更有效地控制仔猪腹泻，减少仔猪腹泻引起的损失，必须通过实验室检测，确定引起仔猪腹泻的主要因素，继而采取针对性防控措施，只有这样才能获得比较好的治疗效果[11-12]。

PEDV 的N 蛋白在病毒感染猪肠壁后的自我复制过程中发挥重要作用，由其编码的病毒核衣壳蛋白具有很好的抗原性[13]，在PEDV 感染早期就能在血液中产生N 蛋白特异性抗体和诱导细胞免疫[14]，因此N基因可以作为PEDV 早期感染检测的目标基因。该猪场感染毒株N基因与疫苗毒株同源性较近，这与翟新国等[15]对河北省一株PEDV S1 基因的遗传变异与重组分析结果一致，说明当前疫苗对防控该毒株有效，因而采取PEDV疫苗紧急免疫，获得了比较理想的防控效果。而陈果亮等[16]发现湖南省一株PEDV 的N基因属于基因I 群，说明我国PEDV 毒株存在多样性。此次在云南省检出的PEDV 阳性样品N基因虽然与经典毒株、疫苗毒株同源性都较高，但其也有基因多样性特点，因此应加强PEDV 的分子流行病学监测，及时了解其变异特性，从而为PEDV 疫苗的改进和更新提供依据。