新型冠状病毒肺炎实验室检测技术进展

魏剑浩 朱召芹

摘 要 新型冠状病毒肺炎是当今世界最受关注的公共卫生问题，实验室检测是其疫情防控的关键环节之一。本文主要介绍现常用的新型冠状病毒实验室检测方法，尤其是核酸、抗原/抗体等检测方法，同时就已见报告的部分新型冠状病毒实验室检测新技术作一简要介绍。

关键词 新型冠状病毒 实验室检测 核酸检测

中图分类号：R512.99； R446 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）17-0006-05

Progress in laboratory techniques for COVID-19 detection

WEI Jianhao， ZHU Zhaoqin

（Department of Clinical Laboratory， Shanghai Public Health Clinical Center， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Coronavirus disease 2019 （COVID-19） has been the most concerned public health disaster in the world today and laboratory detection is one of the key links for epidemic prevention and control. This article mainly introduces the commonly used laboratory detection methods for the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2）， especially the ones such as nucleic acid， antigen/antibody test and so on， and outlines some new technologies for its detection that have been reported.

KEy WORDS SARS-CoV-2； laboratory detection； nucleic acid test

目前，由新型冠状病毒，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019， COVID-19）疫情已导致全球逾1.6亿人感染，340多万人死亡。现阶段我国的疫情防控重点已从严防本土病例暴发转为对境外输入病例的筛查和控制，以及对进口物品携带污染及密切接触人群的监测[1]。随着防疫工作的稳步推进，各级医疗机构和疾病防控部门已常态化开展SARS-CoV-2检测工作。COVID-19是一种席卷全球的传染病，不同的国家或地区都应找到适合自身情况的实验室检测方法，这是当前各国医学实验室的紧急要务。本文主要介绍目前医学实验室常用的SARS-CoV-2检测方法及其技术特点，同时就已见报告的部分SARS-CoV-2实验室检测新技术作一简要介绍。

1 SARS-CoV-2病原学

SARS-CoV-2是一种人畜共患病病毒，其属于β冠状病毒属Sarbecovirus亚属，为单股、正链RNA病毒，常为多形性包膜病毒，颗粒呈圆或椭圆形，直径60 ～ 140 nm。SARS-CoV-2含有4种结构蛋白，即刺突蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白。SARS-CoV-2通过刺突蛋白调节与受体结合和膜融合的过程，并通过刺突蛋白1B结构域特异性地识别宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2， ACE2）。研究发现，SARS-CoV-2的刺突蛋白对ACE2的亲和力较严重急性呼吸道综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus， SARS-CoV）高约10 ～ 20倍[2-3]，这可能是导致SARS-CoV-2在人群中传播更广的原因（表1）。

2 SARS-CoV-2的实验室检测

目前，国内对SARS-CoV-2的实验室检测方法主要有肺部影像学检查、病毒培养及检测、病毒相关核酸检测、病毒特异性抗原/抗体检测等（表2）。

2.1 肺部影像学检查

在COVID-19疫情暴发初期，影像学检查是筛查和发现患者非典型肺部炎症的基本依据[7-8]。但COVID-19的影像学表现并不一致，肺部CT检查时常可见患者双肺多叶磨玻璃样混浊或肺部实变影，呈周围或后部分布样征象。由于存在这些影像学特征，一些回顾性研究认为，肺部CT检查筛查COVID-19的敏感性高（86% ～ 98%），但特异性较低[5]。但也有研究指出，发热、胃肠道症状、感觉减退/丧失或精神神经症状仍可能是COVID-19患者早期的唯一表现[9]。另外，肺部影像学检查也不适用于SARS-CoV-2感染窗口期和无症状的感染者[7]。

2.2 病毒培养及检测

病毒培养及检测是病原学鉴定的金标准，也是目前最贴近科霍原则（Kochs postulates）的COVID-19实验室诊断方法，所获病毒株还是检测试剂、疫苗研发和抗病毒药物筛选等研究的重要基础。特别是在当前英国、巴西、印度等国出现SARS-CoV-2变异株后，我们亟需对这些突变株的传播能力、致病力和免疫逃逸能力等作进一步的研究。鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物等临床样本均可通过接种人呼吸道上皮细胞、猴肾细胞Vero-E6和人肝癌细胞Huh-7细胞系等进行分离培养，应选取经荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）法和/或下一代测序技术（nextgeneration sequencing， NGS）检测为病毒核酸阳性且病毒载量较高的样本进行分离培养。受感染细胞多从细胞边缘开始出现病变或首先变成不规则形态，然后细胞内颗粒逐渐增多，最后细胞圆缩、脱落，而健康的对照细胞形态保持良好。此时可收集培养细胞，并分离出病毒培养株。SARS-CoV-2的培养必须在具备生物安全三级及以上资质的实验室内进行，不得在临床常规生物安全二级的实验室中进行，且需有先进的实验设施和专业的技术人员，成本高，操作时感染风险大，故不推荐用作为COVID-19的常规诊断方法。

2.3 SARS-CoV-2核酸检测

根据国家卫生健康委员会等发布的新版COVID-19诊疗方案，病毒核酸检测阳性仍是发现SARS-CoV-2携带者（SARS-CoV-2核酸阳性，但无明显的临床和影像学表现且血清特异性SARS-CoV-2抗体阴性者）和确诊SARS-CoV-2感染的标准和依据。SARS-CoV-2检测的靶基因主要包括病毒核酸中开放读码框1ab、核衣壳蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白的编码基因。国内迄今批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒均是以上述基因中的1个或多个位点作为靶标来进行检测的。有专家建议，可同时检测2个及以上的靶标，以保证结果的特异性和准确性[2]。国内市场上针对上述靶标设计的核酸扩增检测试剂盒多达数十种，检测方法主要有实时荧光PCR（realtime PCR， RT-PCR）法、恒温扩增法、双扩增法、聚类规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CRISPR associated proteins， Cas）检测法，以及基于NGS的核酸检测方法等。

2.3.1 RT-PCR法

RT-PCR法是目前国内应用最为广泛的SARS-CoV-2核酸检测方法，其能在1次反应中对样本中的多个靶标进行检测，这些靶标既可是同一病原体的不同靶标，也可是不同病原体的同一特征性靶标。但在对COVID-19患者的临床检测中须注意，单次咽拭子采样核酸检测的阳性率并不高，约为30% ～ 50%[1]，故阴性结果不能排除SARS-CoV-2感染，需进一步排除样本采集、运输和实验室操作等各环节中可能存在的问题，对疑似感染患者应重复多次采样检测来避免检测结果假阴性可能。

2.3.2 恒温扩增法

与传统PCR法经一系列重复的变温过程和30 ～ 40个循环完成检测不同，恒温扩增法的扩增反应多于60 ～ 65 ℃下进行，在特异性引物和酶的作用下1 h左右时间内即可大量扩增目标基因，然后通过肉眼或使用荧光染料（如SYBR绿等）进行简单的光度测量就能观察到结果了。恒温扩增法被认为是一种具有高敏感性、高特异性、高效益成本比、高效率和快速的DNA扩增技术，有研究判断该方法的灵敏度较传统PCR法高10倍左右[6]。恒温扩增法还有扩增步骤相对简便的特点，这使其率先成为SARS-CoV-2即时检测所用核酸扩增技术[10]。我国学者创新性地将恒温扩增技术与微流控芯片技术结合起来，设计出适配于智能手机摄像功能的检测模块，希望能够构建一种患者自行采样检测—智能手机上传检测结果—云端分析—反馈结果的SARS-CoV-2检测新模式，目前正处于科研阶段[11]。但恒温扩增法也有缺点和不足，如对引物集的设计要求较高，需有熟练的操作人员和良好的实验室规范来防止污染，需要专门的实验室（区域）来进行检测等。

2.3.3 CRISPR/Cas检测法

CRISPR/Cas系统是细菌的免疫系统，用于对抗外来DNA和RNA的入侵。细菌通过CRISPR RNA和Cas识别目标DNA和RNA，并将入侵的外来核酸裂解。研究显示，利用CRISPR和Cas，主要是Cas12a和Cas13，可用于检测样本中的特异性核酸[12]。Cas12a和Cas13能分别与引导RNA序列指定的RNA或DNA靶标结合，然后无差别地剪切含荧光信号的DNA/RNA探针而产生扩增信号[13]。可利用Cas12a或Cas13结合SARS-CoV-2的特定靶标，通过裂解报告分子来检测有无病毒。已有研究利用基于CRISPR/Cas13的特异性高灵敏度酶促解锁技术完成SARS-CoV-2的检测，成功筛检出10 ～ 100 copies/μL的样本[10]。目前，更多的研究者正在研究将多种扩增技术与CRISPR/Cas技术结合起来，以使CRISPR/Cas检测法发展成为SARS-CoV-2 RNA的下一代快速检测工具[5， 11]。

2.3.4 NGS

在COVID-19疫情初期，NGS即成功帮助我们迅速从患者的样本中鉴定出SARS-CoV-2的基因组序列，找到此次疫情的“元凶”[14]。根据WHO和我国联合发布的报告，仅2019年12月底—2020年2月中旬，我国就分离出104株SARS-CoV-2病毒株，并运用Illumina测序和Oxford纳米孔测序技术对它们进行了测序[15]。Illumina测序是一种使用固相桥放大的序列合成方法，而Oxford纳米孔测序则涉及将DNA分子通过蛋白质孔移位，是经测量移位前后的电压变化来确定DNA序列的。2020年6月，美国FDA同意可紧急使用Illumina公司基于NGS的COVID-19诊断方法[6]，这是NGS首次被批准用于疾病诊断。基因组测序对于设计PCR法和其他核酸检测的引物和探针序列非常重要。但在国内，NGS目前尚主要用于科研探索，尚无大规模临床应用的实例。

2.4 SARS-CoV-2特异性抗原/抗体检测

SARS-CoV-2的免疫检测是SARS-CoV-2实验室检测的重要组成，并被认为是SARS-CoV-2核酸检测的重要补充[3， 16]。国内现有的SARS-CoV-2抗原/抗體检测方法均为定性检测方法，还无法对抗原/抗体进行定量检测。

SARS-CoV-2的特异性抗原检测相对困难，主要的免疫检测抗原靶标是病毒的核衣壳蛋白和刺突蛋白，通常仅在患者急性感染期或血液中病毒载量较高时检测才可得到阳性结果，故尚不能单独用于COVID-19患者的诊断和鉴别[10]。国内迄今批准的SARS-CoV-2抗原检测试剂为数不多。

现有的大多数SARS-CoV-2免疫检测试剂都为针对患者血液或体液中的特异性抗体的检测试剂，它们一般以病毒的核衣壳蛋白和刺突蛋白作为捕获抗原，检测的是样本中对应的免疫球蛋白M和免疫球蛋白G。国内已批准的SARS-CoV-2抗体检测方法主要有化学发光法、胶体金法、荧光免疫层析法、横向流动免疫分析（lateral flow immunoassay， LFIA）法和酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法。化学发光法具有线性范围宽、通量高、自动化程度高、操作易于标准化等特点，但其依赖于特定的化学发光检测仪，成本较高，临床应用受到一定的限制；胶体金法、荧光免疫层析法和LFIA法操作简便、快捷，对检测人员和场所的要求不高，适用于基层医疗单位和现场筛查，但灵敏度较低；ELISA法同样较核酸检测操作简便、快捷，但其需使用特异性和高亲和力的第二抗体（有时需使用昂贵的重组抗体），使之在即时检测中的应用受到限制。有研究显示，ELISA法检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白免疫球蛋白G的敏感性显著高于检测其刺突蛋白免疫球蛋白G的敏感性[6]，但检测免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的敏感性是否也存在差异则还未见相关报告。分析SARS-CoV-2抗体检测相关研究数据发现，单独检测免疫球蛋白M或免疫球蛋白G的特异性较好，而同时检测免疫球蛋白M和免疫球蛋白G或联合检测总抗体（免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和免疫球蛋白A）可提高检出率[17-18]，但应注意此时易受类风湿因子、抗核抗体、严重黄疸等因素的影响而出现假阳性结果[2]。

需指出的是，抗体检测可用于核酸检测阴性的疑似感染患者的补充检测或联合核酸检测用于疑似感染患者的诊断，但不能替代核酸检测单独用作为SARS-CoV-2感染与否的依据，亦不适用于一般人群的筛查[4]。随着SARS-CoV-2疫苗接种人群的逐渐扩大，详细询问患者的疫苗接种史和免疫相关基础疾病对理解其抗体水平的变化及抗体检测结果至关重要。此外，无论是抗原还是抗体检测，临床上多使用患者的血清样本进行检测。但有研究表明，对血清样本热灭活会影响SARS-CoV-2抗体检测的结果，尤其对免疫球蛋白M检测结果的影响更大[19]。因此，在采用ELISA法等免疫分析法检测SARS-CoV-2抗体时，患者的血清样本最好不经热灭活等预处理。不过，此时患者的血清样本仍有感染能力，实验室人员应注意操作的规范性和安全性。胶体金法和LFIA法等免疫检测法还易受环境因素如温度、湿度等的影响，故须对检测环境进行控制。

2.5 其他实验室检测技术

对SARS-CoV-2感染，除上述实验室检测方法外，新的实验室检测技术也不断涌现，其中生物传感器病毒检测平台（biosensing platforms for detecting viruses， BPFDV）就是这些新技术的代表之一。生物传感器通常由功能受体、传感器和信号探测器/分析仪组成，其可感知目标分子并直接向终端用户发送光或电信号等反馈信息。随着纳米技术的不断发展，功能性材料和结构强化技术的进步降低了关键器件的信噪比和采样响应时间，使得基于生物传感器的诊断技术取得了较大进步。BPFDV被认为是未来缓解PCR法检测压力的有效替代解决方案之一[6， 19]。我国Shan等[20]致力于研究SARSCoV-2感染后释放的挥发性有机化合物，以金纳米颗粒作为传感器阵列检测呼出气中的疾病特异性生物标志物，研发的装置能通过挥发性有机化合物与金纳米颗粒表面发生连接反应所引起的电阻信号的变化来完成检测。不过，这种呼出气分析仪虽具有快速筛查COVID-19的潜力，但易受环境湿度和背景疾病等因素的影响，检测的敏感性和准确性均离临床应用的要求有不小的距离[6]。

此外，作为世界人口数量第一的大国，我国的国情决定了各级医学实验室需要具备大规模检测SARSCoV-2的能力。但在一些发达国家，如美国和一些欧洲国家，人口数量较少或人口密度较低，故更关注那些便于携带并能快速进行COVID-19筛查的便携式即时检测设备。这是国外SARS-CoV-2即时检测产品发展迅速的主要原因，相关产品包括GenMark DX公司的ePlex系统、Cepheid公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2检测系统、Abbott公司的ID NOW检测系统、Bosch Healthcare Solutions公司的Vivalytic VRI平台和BioFire Defense公司的FilmArray系统等。Zhen等[21]的研究显示，Xpert Xpress SARS-CoV-2检测系统的阳性符合率为98.3%，检测下限为100 copies/mL；ID NOW检测系统的阳性符合率为87.7%，检测下限为20 000 copies/mL；ePlex系统的阳性符合率为91.4%，检测下限为1 000 copies/mL。在检测所需时间方面，ID NOW检测系统仅需17 min，大大少于Xpert Xpress SARS-CoV-2检测系统的46 min和ePlex系统的约1.5 h。

3 结语

COVID-19的大流行突出了实验室诊断在传染病防控方面的关键作用，也对我国各级医学实验室的能力建设提出了更高要求。我国目前的SARS-CoV-2检测主要在各级定点医学实验室进行。因此，样本运送和结果报告反馈仍需耗费一定的时间。此外，大量样本的检测给实验室人员带来了过重的工作压力，并可能提高交叉污染发生的风险。针对现有检测体系的不足，我们应尽快研发出高通量、多靶标、快速、自动化的检测系统，在保证精度和准确性的同时，减少对实验室条件的依赖，推行分散筛查，提高检测效率，降低患者外出就诊传播疾病的风险。

目前，虽已有中、美、俄、英等国研发的十余种SARS-CoV-2疫苗获准紧急使用，但在世界范围内疫苗的分配和接种情况并不均衡。部分国家和地区的COVID-19疫情仍然十分嚴峻，特别是在部分国家和地区检出的SARS-CoV-2新突变株，它们具有更强的传染性、致病性和免疫逃逸能力，这给实验室检测工作敲响了警钟。医学实验室应做好进一步提高检测能力的准备，以应对疫情变化带来的新挑战。

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