注射用长春西汀中两种磺酸酯类基因毒性杂质的测定

焦洁，王涛，妙苗（陕西省食品药品监督检验研究院，西安 710065）

注射用长春西汀是由主药长春西汀和辅料甘露醇、山梨醇等制成的无菌粉针剂，临床主要用于改善脑梗死后遗症、脑出血后遗症、脑动脉硬化症等诱发的各种症状[1]。其主要成分长春西汀是以长春胺为起始原料，经脱水消除反应、水解反应和酯化反应制得。在长春西汀中间体制备过程中使用了对甲苯磺酸作为催化剂，虽然在后续处理过程中进行了充分的洗涤，但仍然可能残留对甲苯磺酸，在后续的酯化反应中会继续反应生成对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯。对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯为基因毒性杂质，因此需要在成品质量中严格控制其含量。

目前，对甲苯磺酸酯类的检测方法主要有高效液相色谱法[2-7]、液质联用法[8-11]、气质联用法[12-13]等。高效液相色谱法具有低成本、分离效率快、灵敏度高等优点。注射用长春西汀中这两种基因毒性杂质的测定还未见有报道。本研究建立了 HPLC 法测定注射用长春西汀中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的含量，为该药中潜在有害杂质的检测提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），XPE-105 型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

对甲苯磺酸甲酯（批号：F1012054；纯度：98.0%）、对甲苯磺酸乙酯（批号：E1012037；纯度：98.0%）（对照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；注射用长春西汀（15 个厂家，共计92 批样品，包括5 mg、10 mg、20 mg、30 mg 4 种规格）；磷酸（西安试剂厂，分析纯），乙腈（美国天地公司，色谱纯），水为高纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：225 nm；柱温：35℃，进样体积：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯各适量，用流动相溶解并稀释成含对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯各约0.25 μg·mL－1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取供试品1 支，精密加入流动相适量，振摇使溶解并稀释制成每1 mL含长春西汀约为5 mg 的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 辅料空白溶液制备 根据各生产企业提供的注射用长春西汀处方，取甘露醇、枸橼酸、山梨醇、焦亚硫酸钠、维生素C、酒石酸、活性炭、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、亚硫酸氢钠、依地酸二钠等辅料适量，配制辅料空白，称取适量，用流动相溶解并过滤，作为注射用长春西汀辅料空白溶液。

2.3 系统适用性和专属性试验

取流动相（空白溶液）、对照品溶液、加标供试品溶液（按“2.5”项下方法配制）和辅料空白溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。结果显示，对照品溶液出峰顺序依次为对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯，分离度为9.2，理论塔板数分别为13 359 和13 880，空白溶液和辅料对测定无干扰。

图1 专属性色谱图Fig 1 Specific chromatogram

2.4 线性关系考察

精密称取对甲苯磺酸甲酯12.24 mg 和对甲苯磺酸乙酯9.27 mg 同置100 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀。精密量取2.5 mL，置100 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液1、1.5、2、3 和4 mL，分别置20 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，摇匀即得线性对照品溶液。

精密量取线性对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测试，分别获得相应线性方程。对甲苯磺酸甲酯：Y＝6.36×104X－3.09×102，r＝1.000；对甲苯磺酸乙酯：Y＝6.12×104X－3.17×102，r＝1.000；对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯分别在0.15～0.60 μg·mL－1，0.11～0.45 μg·mL－1与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 回收试验

考虑到各企业之间工艺和处方的差别，选择注射用长春西汀使用辅料最多的A 公司样品进行加样回收试验。取A 公司生产的批号为DB190101 的样品6 支（规格10 mg，对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯均未检出），精密加入线性对照品溶液适量，摇匀。

精密量取对照品溶液和上述溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样，按外标法计算回收率。对甲苯磺酸甲酯平均加样回收率为98.9%，RSD＝1.2%；对甲苯磺酸乙酯平均加样回收率为99.5%，RSD＝1.6%。结果表明方法准确度符合要求。

2.6 重复性试验

回收率试验6 份加标样品中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量均值分别为0.0059%、0.0045%，RSD均小于1.6%，表明方法的重复性符合要求。

2.7 定量限和检测限

取线性对照品溶液逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样分析，得对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的定量限（S/N≈10）分别为0.037 μg·mL－1和0.045 μg·mL－1，检测限（S/N≈3） 分别为0.015 μg·mL－1和0.023 μg·mL－1。

2.8 精密度试验

精密量取甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯对照品溶液20 μL（质量浓度分别为0.3、0.23 μg·mL－1，如前配制）连续进样6 次，测得两者峰面积的RSD分别为0.91%和2.0%。表明仪器的精密度良好。

2.9 稳定性试验

取对照品溶液于室温放置 0、1、2、3、4、5、6 h，分别进样分析，记录色谱图，结果发现对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯峰面积有变小的趋势，但在6 h 内峰面积变化RSD＜2.0%，建议供试品溶液在配制后6 h 内测定。

2.10 样品含量测定

取92 批注射用长春西汀样品，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。按外标法计算，结果均未检出甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯。

3 讨论

3.1 流动相的优化

试验中先后考察了① 乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61），检测波长为225 nm；② 乙腈-水（40∶60），检测波长为220 nm；③ 乙腈-0.2 mol·L－1醋酸铵溶液（50∶50），检测波长为260 nm 3 种体系。结果发现，3 种流动相均可满足系统适应性要求，但③的检出限是①和②的10倍，且②的系统耐用性较差，故采用流动相①。

3.2 色谱柱的选择

试验中先后考查了①Waters ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、②Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、③ACE Excel C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱。结果发现，在采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相条件下，3 种色谱柱均可满足系统适应性要求，但在使用②和③色谱柱时2 种待测物均在长春西汀主成分之后出峰，由于供试品溶液浓度较大，有一定程度的拖尾，导致2 种待测物的灵敏度低，达不到限度要求。采用色谱柱①，待测物在长春西汀主峰前流出，可以杜绝高浓度样品拖尾对待测组分的干扰，降低基线噪音，提高检测的灵敏度。

3.3 待测物的确认

试验过程中发现，部分厂家供试品溶液色谱图中，在待测物甲苯磺酸甲酯保留时间附近还有其他色谱峰，为排除因保留时间漂移引起的漏检，对上述样品均进行加标回收验证，结果表明，该色谱峰不是待测物，为长春西汀原料引入的杂质。

3.4 限度的确定

根据ICH 规定，基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg·d－1，长春西汀每日最大用量为30 mg，按此计算，确定本品中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的限度为50 ppm，即不得过0.005%。