江苏地区鸡传染性支气管炎核酸检测及其病毒分离株鉴定和基因序列分析

武小琰，张潇，何旭晖，林建，杨倩

(南京农业大学，江苏 南京 210095)

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)为冠状病毒科丙型冠状病毒属的典型代表种[1]，是影响世界养鸡业的主要病原之一。该病毒引起的鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis)是一种接触传染性、病毒性呼吸道疾病[2]。IBV主要侵害家禽呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统，临床上对蛋鸡的危害最为严重[3-4]。低于2周龄的鸡感染IBV后可能引起输卵管永久损伤，导致产蛋能力下降或丧失。9～18周龄的蛋鸡感染IBV会引起产蛋率显著下降(高达50%)，病程持续8周以上，常出现软壳畸形蛋，蛋清呈水样。IBV暴发后相当长的一段时间内，鸡蛋质量低且蛋壳不平整，对养殖户造成巨大损失。目前，研究的主要重点在于IBV的变异性、致病性及预防控制对策。IBV疫苗免疫保护效果并不理想，原因主要有两点：其一，IBV基因组的RNA酶缺乏严密的校正功能，所以该病毒极易发生突变[5]；其二，该病毒的基因型、血清型复杂，不同血清型之间无交叉反应或交叉反应很小，所以IBV在全球范围内存在广泛流行，影响养禽业发展[6-7]。

IBV为单股正链RNA病毒，基因组全长27.6 kb左右，至少有10个开放阅读框(ORF)，编码小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和纤突蛋白(S)4种主要结构蛋白[8]。其中，S蛋白是决定IBV血清型的主要蛋白，对IBV的传染性、致病性、组织嗜性起着决定性作用，同时能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，是IBV的保护性抗原[9]。因此，S基因的核苷酸序列是IBV分离株分型的重要依据。S蛋白的抗原位点和高变区主要集中位于S1蛋白，当S1蛋白发生基因缺失、插入、重组或突变，就会出现新的血清学和基因型[10]。因此S1基因是研究IBV遗传变异与进化的指示基因，分析S1基因序列有助分析IBV的流行趋势[11]。

为了解江苏省产蛋鸡IBV的流行情况及发展态势，为下一步的防控工作提供参考，本研究采集了江苏省13个地级市的拭子样品进行检测。在此基础上对呈IBV阳性的样品进行病毒分离与鉴定，并对IBV分离株进行全基因测序和S1基因分析，初步明确了江苏分离株遗传演化特点，为下一步防控工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2020年11月，对从江苏省内13个地级市20个家禽养殖场进行样品采集。采集到鸡咽拭子及泄殖腔拭子共计625份，其中泄殖腔拭子314份，咽拭子311份。样品主要来自规模化养殖场，共有573份，其余来自散养户的样品共有52份。样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2 主要试剂

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒、DL2000 DNA Maker，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自康为世纪有限公司；琼脂糖，购自翌圣生物科技(上海)有限公司；50×TAE Buffer、10×PBS，购自Biosharp公司；LB液体培养基；鸡胚由江苏省农业科学院提供。

1.3 采集拭子样品的RT-PCR检测

将采集的拭子样品浸置于500 μL 1×PBS，涡旋振荡20 s，于4 ℃静置20 min，再次涡旋振荡20 s，得到样品拭子浸出液。取200 μL拭子浸出液，参照DNA/RNA快速提取试剂盒说明书提取核酸。检测核酸浓度，去除核酸浓度低于检出下限的样品。根据GenBank上公开的IBV QX亚型序列及M41序列设计引物(表2)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以拭子样品浸出液为模板，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，得到cDNA进行PCR扩增，PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火15 s，72℃延伸2 min，进行35个循环72 ℃延伸10 min，得到PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表2 引物序列

1.4 病毒分离及RT-PCR鉴定

将本次试验中RT-PCR鉴定为IBV阳性的样品12 000 r/min，离心5 min，收集上清，经0.22 μm滤膜过滤后接种于11日龄的鸡胚，接种病料后48 h后收取尿囊液。用TRIzol法提取尿囊液样品核酸，参照诺唯赞反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。用特异性引物进行PCR扩增，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。取单一目的条带，参照Gel Extraction Kit 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 病毒分离株的全基因组测序及序列分析

1.5.1 引物设计及合成

IBV基因组序列从5′→3′顺序依次为：5′-UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c(E)-M-5a-5b-N-UTR-3′，将其分为7个片段，根据GenBank中公布的IBV基因组序列，利用SnapGene软件设计针对IBV全基因序列的7对特异性引物，引物信息见表3，引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.5.2 IBV分离株的全基因组序列分析

通过DNAMAN软件对测序结果进行拼接整理。以NCBI数据库中下载的18株IBV全基因序列作为本研究的参考毒株(表4)，通过MEGA-X软件的Neighbor-Joining算法绘制基于全基因序列的进化树，并使用BioEdit软件进行核酸及氨基酸同源性比对。

表4 IBV参考毒株全基因的信息

1.5.3 IBV分离株基于S1基因的遗传进化分析

从全基因组序列中截取S1基因序列。从NCBI数据库中下载36株IBV S1基因序列作为本研究的参考毒株(表5)。通过MEGA-X软件Neighbor-Joining算法构建基于S1基因序列的系统进化树。使用BioEdit软件进行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比对分析。

表5 IBV参考毒株S1基因的信息

2 结果与分析

2.1 采集拭子样品的RT-PCR检测

以江苏省各地区拭子样品为模板进行RT-PCR鉴定，扩增产物经凝胶电泳检测。QX亚型检测结果显示：产物呈单一条带，大小约为211 bp，与目的条带大小相符(部分样本的扩增结果见图1)。将目的条带切胶回收，测序证实扩增产物为IBV QX亚型。M41未检出。

M.DL2000 DNA Marker；1～23.部分拭子样品；24.阴性对照

江苏省13个地级市的IBV核酸检出结果如表6所示，2020年11月共计625份样品中，除去核酸浓度低于检出下限的120份样品，余下的505份样品平均IBV QX亚型阳性检出率为14.46%(73/505)。根据样品采集地区进行分类，检出率由高至低依次为无锡 100%(60/60)、常州 20%(8/40)、南京 8%(2/23)、盐城 4.1%(3/72)，其余检测点IBV核酸检测无阳性结果。依据养殖类型来看，检测出IBV核酸阳性的鸡场均为规模化养殖场。

表6 IBV QX亚型核酸检测阳性结果

2.2 IBV分离株全基因序列测序

采用本研究设计的IBV全基因7个片段设计的特异性引物，对IBV分离株鸡胚尿囊液进行RT-PCR检测，所得目的片段与预期大小一致。通过DNAMAN软件对测序结果进行拼接整理，确定本研究分离的IBV江苏分离株全基因组大小为27 689 bp，其中S1基因的全长为1 620 bp，命名为NEWQXIBV。

2.3 IBV分离株全基因组序列分析

为了研究本试验分离得到的IBV分离株与我国早期毒株以及与其他各国毒株之间的遗传演化关系，将分离株的全基因序列与各参考毒株的全基因序列构建系统进化树，结果如图2。分离毒株和所有参考毒株形成7个不同的进化分支(基因型)，分别为基因型GⅠ～GⅦ[12]，分离株与基因型GⅠ(类QX型)亲缘关系最近。

▲本研究分离鉴定毒株。下同

2.4 IBV分离株基于S1基因的遗传演化分析

根据分离株S1基因绘制的系统进化树，结果见图3。分离毒株和所有参考毒株形成7个不同的进化分支(基因型)，分别为基因型GⅠ～GⅦ型，分离株与GⅠ型(类QX型)亲缘关系最近。通过同源对比发现，分离株与GⅠ型参考代表毒株QXIBV核苷酸和氨基酸的同源性分别为94%和96.2%(如图4、图5)。推导的氨基酸序列显示，分离株S1基因裂解位点为HRRRR，与GⅠ分支所有参考毒株裂解位点一致，为中国IBV毒株所特有。

图3 分离株S1基因与参考株全基因序列系统进化树

图4 IBV分离株与参考毒株S1基因氨基酸序列同源性比对分析

图5 IBV分离株与参考毒株S1基因核苷酸序列同源性比对分析

3 讨论

近年来，我国养鸡业不断向规模化、集约化方向发展，合理的养殖方式和及时的疫病监测为家禽养殖提供了科学保障。随着养殖户防控意识提高，对养鸡业造成影响的部分疫病已经得到有效控制，但仍有一些传染病对养鸡业产生威胁。影响蛋鸡养殖的传染病病原通常存在于被感染家禽的消化道、呼吸道和内脏组织器官中，因此病原可以随病禽的眼、鼻、口腔分泌物及粪便排出，被污染的任何物体都可以传播病原。了解传染性支气管炎的流行情况及发展态势，才能有针对性的加强防控。为了解江苏地区传染性支气管炎流行情况，本研究对江苏省13个地级市的蛋鸡鸡群进行流行病学调查和分析。结果表明江苏地区IBV QX亚型的平均阳性率为14.46%，而M41亚型未检出，说明江苏地区的IBV仍然以QX型为主。

自20世纪30年代被发现以来，IBV在几乎所有的养鸡国家存在。IBV不同的血清型和遗传型的病毒已经在世界范围内被鉴定出来，大多数情况下不具有交叉保护作用。截至目前，中国至少存在3种基因型[13]，16个谱系，超过70%的传染性支气管炎病例都是QX型的病毒引起[14]。目前我国使用的活疫苗属于Mass血清型，该疫苗自1960年研制成功并应用至今[15]，被证明是所有传染性支气管炎疫苗中效果最好、保护范围最广的疫苗，但该血清型与我国流行的QX型同源性较差[2]，传染性支气管炎极难得到有效控制。

本研究通过SPF鸡胚接种和鸡胚尿囊液的RT-PCR鉴定，于江苏省各地区IBV阳性的样品中分离病毒，并对其全基因进行序列测序，得到1株全长27 689 bp的IBV全基因组序列。基于S1基因进行核苷酸和氨基酸同源性比对，结果表明IBV分离株序列与GⅠ-19谱系(QX型)参考毒株间核酸和氨基酸同源性最高，为94%和95.4%，且具有相同的HRRRR裂解位点特征，属于基因型Ⅰ(类QX型)。本研究结果表明，江苏省地区流行IBV毒株为国内优势基因型毒株，现有Mass型疫苗可能难以起到免疫保护作用，因此有必要对江苏省IBV进行持续的流行病学监测。建议蛋鸡养殖场做好防控，选择针对流行毒株的本地疫苗，可有效提高疫苗免疫保护率，减少养殖户经济损失。