可溶性E-钙黏蛋白相关的氧化应激在慢性乙型肝炎患者中的临床研究

丁惠惠，陈 红，丁小娟，杜艳娥，王 波

(重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 400010)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是人类最常见的传染病之一。据报道，每年约有100万人病亡于HBV相关疾病，如HBV相关癌症和终末期肝病[1]。因此，HBV感染仍然是一个严重的全球健康问题，但CHB病毒感染的确切机制仍不清楚。

在过去的几十年里，越来越多的证据表明活性氧(ROS)(包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢和单线态氧)作为重要的调节因子，促进了HBV与肝脏疾病的发生和发展。研究表明，HBV编码的X蛋白诱导ROS产生，通过Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)(VPS34)/beclin-1和c-Jun N-末端激酶信号途径在HBV复制中起着至关重要的作用[2]。迄今为止，氧化应激在HBV相关疾病中的病理生理相关性尚有待阐明，未来的研究需要关注ROS在HBV相关病理过程中的作用。

E-钙黏蛋白(E-cadherin)是一种跨膜糖蛋白，主要存在于上皮细胞中，是一种已知的侵袭/转移抑制因子。目前，研究证据表明，E-cadherin可能是一个信号转导平台。E-cadherin可被多种蛋白酶分解，包括基质金属蛋白酶、激肽释放酶7和纤溶酶，从而导致细胞外N-末端可溶性片段(80 kDa)的释放，称为可溶性E-钙黏蛋白(sE-cadherin)[3]。长期以来，人们认为sE-cadherin仅作为非功能性肽发挥作用。越来越清楚的是，sE-cadherin可以启动各种信号级联，最终导致病理生理反应。WANG等[4]的最新研究表明，sE-cadherin可能是导致HBV相关肝病发生和发展的细胞因子之一。有研究表明，与健康人相比，前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌和肝癌患者的sE-cadherin水平要高得多[5]，但sE-cadherin在慢性乙型肝炎(CHB)中作用的分子机制尚不清楚。

本研究主要评估CHB患者血清sE-cadherin水平和氧化/抗氧化能力的变化，从而更好地了解sE-cadherin与CHB患者氧化应激状态之间的相互作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年7月至2018年4月重庆医科大学第二附属医院在获得书面知情同意后，招募HBV阳性或阴性的受试者作为研究对象。血清样本包括105例CHB患者、112例非活动性HBV携带者和109例健康人[HBV、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染呈阴性]。根据《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[6]确定CHB患者和非活动性HBV携带者，在本研究登记前6个月内未接受抗病毒治疗。在此研究中，作者也使用包括磁共振成像和计算机断层扫描的成像技术来识别CHB和其他肝脏疾病。本研究经重庆医科大学第二附属医院伦理委员会批准，按照赫尔辛基宣言的原则进行。

1.2方法

1.2.1血清采集 采集人外周血，室温保存30 min凝固，转速3 000 r/min离心10 min。立即分离血清上清液并在-80 ℃下保存。

1.2.2肝功能试验 血清样品中的肝酶水平[谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)]根据制造商的说明，使用肝功能检测试剂盒(中国四川迈克)进行定量。

1.2.3乙型肝炎病毒DNA定量 采用CFX-Connect实时PCR检测系统(CA)检测血清HBV-DNA水平，一式三份进行检测，程序遵循制造商的说明。

1.2.4sE-cadherin、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的酶联免疫吸附测定 用人血清sE-cadherin双酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D系统，MN)测定血清sE-cadherin水平。用人GSH-ELISA试剂盒(EIAAB,中国武汉)检测血清GSH浓度。用人MDA ELISA试剂盒(EIAAB，中国武汉)测定血清MDA含量。所有血清样本按照制造商的说明一式三份进行检测，平均值用于统计分析。

1.2.5超氧化物歧化酶(SOD)的测定 采用SOD检测试剂盒(WST-1法，南京建成生物工程研究所)测定血清SOD浓度。

1.2.6NADPH氧化酶2(NOX2)的ELISA测定 采用ELISA法检测可溶性NADPH NOX2肽的水平。在此研究中调整了该方案，以测量乙型肝炎患者的血清NOX2浓度[7]。具体操作步骤：(1)每个抗NOX2抗体包被良好(antiNOX2/gp91phox抗体)。(2)加入100 μL血清样品或标准品，摇动时在室温下孵育2 h。(3)清洗3次后，在每个孔中加入100 μL稀释的辣根过氧化物酶结合检测抗体(Abcam)，随后在室温下孵育1 h，同时轻轻搅拌。(4)再次抽吸和清洗每个孔3次，所有孔添加100 μL酶底物溶液，然后在室温下孵育20 min。(5)向所有孔中加入50 μL的1 mol/L硫酸溶液(H2SO4)，即停止溶液。(6)利用Multiskan-FC微板阅读器(MA)在450 nm处分析吸光度。

1.2.7总抗氧化能力(TAC)和总氧化活性(TOA)的测定 用自动测定技术测定TAC和TOA[8]。TAC和TOA的结果分别表示为mmol Trolox Eq/L和μmol H2O2Eq/L。

2 结 果

2.1健康人和患者血清sE-cadherin水平 初始诊断时受试者的临床特征见表1。与健康人相比，HBV相关疾病患者的血清sE-cadherin水平明显升高。乙型肝炎包膜抗原(HBeAg)阴性(-)的CHB患者(平均值566.31 pg/mL)和HBeAg阳性(+)的CHB患者(平均值672.55 pg/mL)的血清sE-cadherin浓度明显高于健康人(平均值：309.54 pg/mL；P<0.01)。健康人和非活动性HBV携带者之间没有明显的变化。HBeAg阳性CHB患者的血清sE-cadherin水平明显高于HBeAg阴性CHB患者，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 本研究受试者的临床特征

表2 各种人血清样本中sE-cadherin水平间相关性

2.2血清sE-cadherin水平与肝酶标志物相关性 HBeAg(-)和HBeAg(+)CHB患者的血清ALT和AST水平明显高于健康人。而且HBeAg(-)CHB患者的血清ALT和AST水平明显低于HBeAg(+)CHB患者。此外，HBeAg阴性CHB患者的血清sE-cadherin水平与ALT之间存在显著相关性(P<0.01)，与AST之间存在显著相关性。HBeAg(+)CHB患者的血清sE-cadherin水平与ALT之间存在显著相关性(P<0.01)，与AST之间存在显著相关性(P<0.01)。见表3。

表3 血清sE-cadherin水平与ALT和AST的相关性

2.3血清sE-cadherin水平与抗氧化能力相关性 CHB患者的血清GSH和SOD水平与健康人相比明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。而HBeAg(-)和HBeAg(+)的CHB患者之间无显著差异(P>0.05)。在CHB患者中，血清sE-cadherin和TAC之间呈显著负相关(P<0.01)。在CHB患者中观察到血清sE-cadherin和抗氧化酶，包括GSH和SOD之间呈强负相关(P<0.01)。见表4。

表4 血清sE-cadherin水平与抗氧化标志物的相关性

2.4血清sE-cadherin水平与氧化应激标志物的关系 CHB患者血清TOA的平均水平与血清sE-cadherin水平的增加成正比(P<0.05)。CHB患者的血清sE-cadherin和氧化标记物(包括NOX2和MDA)水平的增加呈正相关(P<0.01)。见表5。

表5 血清sE-cadherin水平与氧化应激标志物的相关性

3 讨 论

血清sE-cadherin在上皮细胞行为和组织形态发生/重塑中起着重要作用。在不同的病理条件下，血清sE-cadherin的胞外段可以被多种蛋白酶切割，血清sE-cadherin水平的升高与癌症、传染病和炎症相关疾病有关，血清sE-cadherin还作为一个关键的炎症信号节点[9]。越来越多的证据表明，血清sE-cadherin水平的升高可能与全身炎症反应的严重程度及多器官衰竭有关。本研究表明，血清sE-cadherin可能是HBV相关疾病进展的一个关键生物标志物。

本研究表明，与健康人相比，CHB患者的血清sE-cadherin浓度显著增强。在HBeAg(-)和HBeAg(+)的CHB患者中，ALT和AST活性与血清sE-cadherin呈显著正相关。本研究结果显示，血清sE-cadherin可以作为一个重要的角色，有助于CHB的发生和发展。

此外，在非活动性HBV携带者和健康个体之间未观察到明显的变化。这一现象可以解释为：(1)血清sE-cadherin水平的升高与HBV相关疾病的发生有关；(2)非活动性HBV携带者的大多数炎症标志物和免疫反应通常是正常的。

迄今为止，HBV介导的ROS可导致慢性感染和炎症，从而导致严重肝病[1]。升高的血清sE-cadherin水平表示完整的E-cadherin分裂增加，继发于蛋白酶活性上调或活化中性粒细胞释放自由基导致组织结构和功能丧失。据报道，ROS降低了血清sE-cadherin的表达[10]。因此，血清sE-cadherin是否是CHB中的氧化应激标志物仍有待进一步确定。

本研究表明：(1)CHB患者的TAC、GSH和SOD水平低于健康人；(2)HBeAg(-)和HBeAg(+)CHB患者的血清sE-cadherin水平与TAC、GSH和SOD呈显著负相关。目前，很少有研究评估HBV中血清sE-cadherin与氧化应激之间的相互作用。本研究结果显示血清sE-cadherin水平升高的CHB患者中，抗氧化水平显著降低。

为了解CHB患者血清sE-cadherin变化的认识，进一步研究血清sE-cadherin水平与氧化标志物之间的关系。本研究显示，健康人的血清TOA、NOX2和MDA水平低于CHB患者；血清氧化标记物与血清sE-cadherin浓度呈正相关。本研究中，CHB患者的MDA水平比健康人更高，并且与血清sE-cadherin水平呈正相关来验证和扩展这些结果。本研究提示，血清sE-cadherin水平的升高，结合NOX2水平，可能是HBV感染慢性进展中一个有用的新氧化标志物。

综上所述，本研究提供了新的临床观点，即血清sE-cadherin可能是反映HBV感染发展和进展中炎症和氧化应激的一个新的候选生物标记物。因此，需要进一步的纵向和前瞻性研究，以引入更多与HBV相关的肝硬化和HCC患者，评估血清sE-cadherin反映氧化应激的实用价值，并进一步阐明这些患者的脱落机制和血清sE-cadherin的病理生理学作用。