贵州地区981例人巨细胞病毒荧光定量PCR检测结果分析*

许永杰，罗振元，叶芝旭，余福勋，王树辉

(贵州省人民医院:1.检验科;2.儿科;3.中心实验室，贵州 贵阳550002)

人巨细胞病毒(hCMV)是一种潜伏性双链DNΑ病毒，属于β疱疹病毒亚科[1]。hCMV感染在临床上较为普遍，是引起围生儿病毒性感染的常见病因。hCMV侵入人体后可在宿主体内长期持续存在，免疫功能正常个体多表现为无症状感染，但病理性和生理性免疫低下人群，尤其免疫系统发育不成熟的胎儿、婴幼儿，其可侵袭多个器官、系统，造成先天性或围生期疾病等，且年龄越小易感性越高[2-3]。实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是临床实验室诊断hCMV感染的快速检测技术。本文回顾性分析本院2021年2-4月送检的血液和尿液样本中hCMV-DNA的FQ-PCR检测结果，共981例，为临床合理诊断hCMV感染提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年2-4月进行hCMV-DNA检测项目的血液和尿液样本作为研究对象，回顾性分析2种样本hCMV-DNA的FQ-PCR检测数据，并采集有临床诊疗价值的阳性标本信息，但不涉及患者个人隐私信息。

1.2方法

1.2.1试剂与仪器

1.2.1.1试剂 hCMV核酸检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)，人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.2.1.2仪器 Genlier96e型FQ-PCR仪(西安天隆科技有限公司)。

1.2.2方法

1.2.2.1尿液于12 000 r/min条件下离心10 min后吸去上清液，在尿沉渣中加入hCMV-DNA检测FQ-PCR试剂盒中的DNA提取液50 μL并混匀后在100 ℃金属浴中放置10 min，最后提取混合液于12 000 r/min条件下离心10 min，其上清液备用于后续FQ-PCR检测。

1.2.2.2乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝全血缓慢加入到单个核细胞提取液试管中并于3 000 r/min条件下离心15 min，之后吸取淋巴细胞白膜层并用生理盐水洗涤1次，洗涤后细胞沉淀同于尿沉渣提取条件下提取hCMV-DNA备用后续FQ-PCR检测。

1.2.2.3实验步骤 从尿液和血液标本的hCMV-DNA提取液中吸取上清液2 μL加入至43 μL FQ-PCR体系。在Genlier96e型FQ-PCR仪上运行如下程序：第1阶段：预变性(1个周期)，93 ℃ 2 min；第2阶段：两步法扩增(10个周期)，93 ℃ 45 s(变性)，55 ℃ 60 s(退火/延伸)；第3阶段：两步法扩增(30个周期)，93 ℃ 30 s(变性)，55 ℃ 45 s(退火/延伸)。FQ-PCR试剂盒中定量参考品稀释至104、105、106、107copies/mL标准浓度与临床样本行相同操作，以建立线性方程用于临床样本中hCMV-DNA的定量检测。hCMV-DNA定量值低于500 copies/mL判读为阴性，大于或等于500 copies/mL且小于104copies/mL判读为弱阳性，大于或等于104copies/mL判读为阳性。

1.3统计学处理 采用 SPSS16.0 统计软件对数据进行分析，不同类型标本hCMV感染阳性率采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1临床检测样本中不同性别受检者hCMV-DNA阳性率分析 981例hCMV-DNA检测样本中男性hCMV-DNA的阳性率显著高于女性(P<0.01)。见表1。

表1 981例hCMV-DNA检测样本中不同性别受检者阳性率分析

2.2不同类型临床检测样本hCMV-DNA阳性率分析 981例hCMV-DNA检测样本中，尿液样本的阳性检出率显著高于血液样本(P<0.01)。见表2。

表2 981例hCMV-DNA检测样本中血液和尿液阳性率分析

2.3临床不同类型样本hCMV-DNA联合检测结果对比分析 167例阳性样本中，尿液和血液hCMV-DNA联合检测呈阳性的样本数共91例。收集该91例患者hCMV-DNA的FQ-PCR数据信息，按照定量判断标准对2种标本类型的阳性率进行对比分析。联合检测91例阳性标本中，尿液标本检测阳性88例，阴性3例，阳性率为96.70%；而血液标本阳性25例，阴性66例，阳性率为27.47%。见表3。

表3 91例联合检测样本中血液和尿液hCMV-DNA检测阳性率对比分析

2.4hCMV-DNA检测阳性患者的年龄分布特征 收集167例阳性样本来源患者年龄信息并进行统计分析，因婴幼儿免疫力未发育成熟，易受hCMV感染，且随年龄增加免疫力逐步增强，机体不易受巨细胞病毒感染，故1-12月阶段按月份进行样本量统计，发现2～4个月的婴幼儿hCMV-DNA阳性率高于其他月龄段。1～9岁阶段按年份进行样本量统计，10岁以上按年龄段进行样本量统计。见表4。

表4 167例hCMV-DNA阳性样本在不同年龄组的分布情况

3 讨 论

hCMV感染在我国极其广泛，一般人群hCMV抗体阳性率为86%～96%，孕妇约为95%，婴幼儿期为60%～80%，原发感染多发生于婴幼儿时期，一旦感染，将持续终身[4]。在新生儿期检出病毒DNA是原发感染的证据。目前，临床检测hCMV感染的主要标本来源有血液、尿液、唾液、乳汁、脐带血等。本文针对临床受检者血液和尿液中981例hCMV-DNA定量检测结果进行回顾性统计分析。从表1中可以看出，981例hCMV-DNA定量检测结果中男性hCMV-DNA阳性率高于女性。从表2中可以看出，尿液样本hCMV-DNA阳性率为39.22%，而血液分离单个核细胞样本hCMV-DNA阳性率为9.22%，2种检测方法差异有统计学意义(P<0.05)。该报道中2种标本检测阳性率低于朱艳等[5]报道的尿液样本阳性率为70.43%和血液分离单个核细胞样本阳性率为49.09%，但2项结果均显示尿样本阳性率比血样本阳性率高。唾液腺和肾脏是hCMV感染的最主要排毒部位，尿液中可能存在高浓度的hCMV-DNA载量，可造成尿液样本hCMV-DNA阳性率显著高于血液分离单个核细胞样本。

为更准确地分析2种样本基于Genlier96e型实时荧光定量PCR仪检测阳性率的差异，在167例检测阳性样本中筛选出感染者在同一时期内2种样本联合检测的样本共91例。因hCMV具有潜伏-活化的生物学特性且hCMV-DNA载量与活动性感染呈正相关，高载量或动态监测中出现载量明显升高提示活动性感染可能，故根据判断标准将hCMV-DNA载量不同的91例阳性标本分为弱阳性和阳性进行2类不同样本检出情况分析。从表3中可以看出，尿标本hCMV-DNA弱阳性而血液样本阴性标本占比16.48%，尿标本hCMV-DNA阳性而血液样本阴性标本占比56.04%，2种情况合计高达72.53%；血液样本hCMV-DNA弱阳性而尿标本阴性占比2.20%，血液hCMV-DNA阳性而尿标本阴性占比1.10%，尿样本2种情况合计低至3.30%。基于2种样本联合检测结果，尿标本检测阳性率高达96.70%，而血液样本阳性率低至27.47%。另外，血液样本hCMV-DNA阳性而尿标本阴性的1例标本患者在2021年5月3日尿定量hCMV-DNA检测中呈阳性，血尿2种类型标本阳性结果具有一致性。从FQ-PCR结果推知，当临床感染症状时，血液样本当联合尿标本同时送检进行hCMV-DNA检测，以避免漏诊hCMV感染。该结果可能部分由于年长儿和成人免疫正常时，hCMV感染多局限于唾液腺和肾脏，少数累及淋巴细胞。另外，由于肾脏是无症状hCMV感染者常见排毒部位且排毒时长可达数年之久，尿液中检出hCMV-DNA需谨慎解释[4]。hCMV感染高发人群主要包括母亲孕期有原发感染或再发感染的新生儿，1岁以下婴儿，接受骨髓、干细胞或实体器官移植者，接受大剂量或长期免疫抑制剂或糖皮质激素治疗者等[4,6-7]。从表4中可以看出，167例阳性样本来源患者年龄信息，12月龄以内例数最多共117例(包括1例4 d新生儿)，占总阳性数的70.06%，其中2～4个月龄比例数最多，占此月龄段患儿的56.41%；2～9岁23例，占总阳性数的13.77%，其中2～4岁幼儿例数最多，占此年龄段患儿的86.96%；20岁以上成人27例，散在分布。此结果与1岁以下婴儿属于高峰人群相符[4]，且显示2～4个月龄具有占比最高的分布特点。

本研究分析主要针对Genlier96e型FQ-PCR仪定量检测尿标本和血液分离单个核细胞样本的hCMV-DNA的结果进行统计分析。由于hCMV感染存在多种检测方法[8-10]，hCMV-DNA阳性结果与临床hCMV感染诊断结果之间存在偏差。从表3中可以看出，hCMV-DNA阳性率统计时直接用尿标本和血液分离单个核细胞样本hCMV-DNA阳性例数作为hCMV感染例数，此种方法统计的检测阳性率虽与临床hCMV感染实际检测阳性率存在偏差，但可真实反映基于FQ-PCR法检测2种不同临床样本在诊断hCMV感染中的分析性能。从表4中可以看出，对hCMV-DNA阳性标本来源的月龄/年龄分布进行分析，但由于感染临床表现症状多样性，未对每个年龄段对应的临床诊断进行统计分析。hCMV-DNA阳性患者的临床症状中有58例表现为支气管肺炎，13例表现为肺炎，18例表现为肝胆系统疾病，6例表现为血小板减少，4例表现为肾脏系统疾病等，这与巨细胞感染相关的肺炎[11-12]、肝肝胆疾病[13]、血小板减少[14]和肾脏疾病[15]等临床症状相符。统计发现，送检样本中有血液标本726例和尿液标本255例，然而尿液标本较血液分离单个核细胞样本hCMV-DNA阳性率高，且尿液具有易采集、接受率高和检测操作过程简便等优势，巨细胞感染诊断应提高尿液标本送检率。

综上所述，血液和尿液hCMV-DNA联合检测可提高hCMV感染诊断的准确性，对于血hCMV-DNA检测结果为阴性，但结合临床症状与体征hCMV感染可能性较大的患者，应及时进行尿hCMV-DNA检测，从而实现早期诊断和早治疗。