E-cadherin表达和TSHR甲基化在甲状腺乳头状癌中的诊断价值及意义

周淑敏 宋艳芳 张丽华

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲状腺癌常见病理类型，以淋巴结转移为主要特点，通常女性发病率远远高于男性[1]。近年来，该肿瘤发病率逐渐增加，虽然随着影像学技术的发展，其临床诊断准确率得到保证，但是该肿瘤的生存率未得到显著改善。相关研究显示：患者年龄<45岁、肿瘤最大径>1 cm、多灶病变可导致PTC中央区淋巴结转移的风险增加[2-3]。因此甲状腺乳头状癌相关靶基因的筛查对该癌症的诊断意义重大。研究显示：在PTC的低风险和高风险组中，E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达存在差异，高风险组织学变种的侵袭行为与细胞质E-钙粘着蛋白的表达增加有关[4-5]。另外也有研究显示：PTC组织中TSHR基因启动子区常出现甲基化现象，并且与颈部淋巴结转移、临床分期等密切相关，可能是引起该癌症发展及转移的机制之一[6-7]。鉴于此，本研究前瞻性选择162例PTC患者的癌组织及癌旁组织样本，采用免疫组化和实时荧光定量甲基化特异性PCR(q MSP)法分别检测患者PTC病灶组织及癌旁组织中及E-cadherin和TSHR启动子区甲基化状态，并进一步对E-cadherin表达和TSHR甲基化在甲状腺乳头状癌中的诊断价值及意义进行分析，以期对该癌症的诊断及发病机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月至2020年6月于周口市中心医院进行手术的162例甲状腺乳头状癌患者的癌组织标本为本次研究对象。所有PTC患者均未接受过放化疗及免疫治疗、无其他严重并发症及恶性肿瘤且临床资料完整。所有患者中，鳞癌89例、腺癌73例；TMN分期：Ⅰ期43例、Ⅱ期61例、Ⅲ期39例、Ⅳ期19例；颈部淋巴结转移70例、未发生颈部淋巴结转移92例；取65例癌旁组织标本作为对照。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化(SP法)检测E-cadherin表达 采用免疫组化(SP法)检测PTC癌组织及癌旁组织中E-cadherin的表达：采用鼠抗人E-cadherin单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒(购自美国赛默飞世尔科技公司hermo Fisher Scientific)，将组织固定，然后根据石蜡切片制作流程包埋并切片，根据试剂盒说明书流程进行染色，最后DBA显色，光学显微镜下观察并拍照。采用双盲法，由我院病理科两位医师按照表1对染色结果进行阳性判断。

表1 阳性判定标准

1.2.2 甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)法检测TSHR甲基化[8]采用MSP法检测PTC癌组织及癌旁组织中TSHR甲基化情况。即从癌组织及癌旁组织样本中提取DNA，采用DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒(购自ZYMO RESEARCH)对DNA进行亚硫酸氢盐修饰，将已修饰的DNA作为模板，在ProFlex PCR仪(厂家：美国赛默飞世尔科技公司hermo Fisher Scientific，货号：4484075)中利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，扩增条件根据试剂盒说明进行设置和操作，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3 诊断结果计算

灵敏度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异性=真阴性数/(假阳性数+真阴性数)×100%；准确性=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%。

1.4 统计学方法

应用GraphPad Prism 6.0软件进行数据处理和分析，所得数据资料均为计数资料，以(%)表示，组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 E-cadherin和TSHR在癌组织中表达及甲基化程度比较

与癌旁组织相比，癌组织组E-cadherin高表达、TSHR甲基化以及两者联合检测阳性例数均显著高于癌旁组织(P均<0.001)，见表2。

表2 各组E-cadherin和TSHR在癌组织中表达及甲基化程度比较(例，%)

2.2 E-cadherin表达和TSHR甲基化与患者主要临床特征的相关性

E-cadherin表达和TSHR甲基化PTC患者例数在不同肿瘤直径患者中差异无统计学意义(P>0.05)，颈部淋巴结转移PTC患者E-cadherin高表达例数显著高于低表达PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例数显著高于非甲基化PTC患者，差异均具有统计学意义(P均<0.01)，见表3。

表3 E-cadherin表达和TSHR甲基化与患者主要临床特征的相关性(例，%)

2.3 两个指标对PTC诊断的灵敏度、特异性和准确性比较分析

E-cadherin高表达联合TSHR甲基化对PTC诊断的灵敏度、特异性和准确性较单项检测均出现上升趋势，但仅灵敏度与单一检测相比差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两个指标对PTC诊断的灵敏度、特异性和准确性比较分析/%

3 讨论

PTC是甲状腺癌中最常见的肿瘤类型之一，约占80%，为分化程度高且预后良好的一种类型，但是淋巴结转移(lymph node metastasis,LNM)在PTC中较为常见且预后不良，近年来其发病率急剧增长，因此其早期诊断对癌症的治疗及生存率的提升至关重要[9-11]。相关研究提出：人类癌症临床结果的改善需要表征其发病机理的遗传改变，针对PTC来说，西方人群中已揭示出多种致癌驱动因素，这对于该癌症的致病机制的探索至关重要，而到目前为止，中国PTC患者的遗传状况仍未完全阐明[12]。此外，遗传变异和临床病理特征的综合分析表明，激酶基因融合与PTC诊断时年龄较小，肿瘤较大和淋巴结转移有关。此外有研究通过分析PTC中RET基因融合的DNA重排位点，PTC与RET融合事件相关的染色体易位的也有关[13]。因此近年来与PTC诊断相关的靶基因研究中涉及到多种基因的表达和甲基化检验：如：p16、NIS、TSHR等基因的甲基化以及标志物TGF-β1、CK19、CK19和CD31等蛋白的表达。

E-cadherin是Cadherin家族中的一员，主要分布于上皮组织中，介导细胞间的粘附功能，研究显示其可能与甲状腺乳头状癌的侵袭以及其发生和进展密切相关，并对其诊断具有重要意义[4,14]。TSHR基因是甲状腺点代谢的关键基因，其甲基化是PTC组织中频发的分子事件，与肿瘤的进展相关并提示PTC患者的不良预后[8]。本研究前瞻性选择162例甲状腺乳头状癌患者的癌组织及65例癌旁组织样本，分别采用免疫组化(SP法)和甲基化特异性PCR(MSP)法检测E-cadherin表达情况和TSHR甲基化程度，E-cadherin表达和TSHR甲基化在PTC患者中的诊断结果显示：癌组织组E-cadherin高表达、TSHR甲基化以及两者联合检测阳性例数均显著高于癌旁组织(P均<0.001)，表明在PTC癌组织中E-cadherin呈现高表达且TSHR甲基化程度增加，与前人研究结果一致[4,15]。

另外，E-cadherin表达和TSHR甲基化PTC患者例数在不同肿瘤直径患者中差异无统计学意义(P>0.05)，颈部淋巴结转移PTC患者E-cadherin高表达例数显著高于低表达PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例数显著高于非甲基化PTC患者，差异均具有统计学意义(P均<0.01)，表明：E-cadherin的高表达和TSHR的甲基化预示着PTC患者发生淋巴结转移且临床分期程度较高，从而对该癌症的临床诊断具有一定价值。此外，E-cadherin高表达联合TSHR甲基化对PTC诊断的灵敏度、特异性和准确性较单项检测均出现上升趋势，但仅灵敏度与单一检测相比差异具有统计学意义(P<0.05)，表明：E-cadherin表达联合TSHR甲基化检测在PTC的诊断中具有较高灵敏度，而在本研究中，E-cadherin高表达联合TSHR甲基化对PTC诊断的特异性和准确性虽数值上有所增加，但是差异无统计学意义，这可能与本研究中纳入的样本量，尤其是癌旁组织样本量较少有关，后续将扩大样本量对该问题进行深入计算和分析。

综上，E-cadherin表达和TSHR甲基化与PTC患者颈部淋巴结转移情况以及TNM分期密切相关，且E-cadherin高表达联合TSHR甲基化对PTC临床诊断具有较好的灵敏度。