miR-21、miR-221、miR-106a在儿童骨肉瘤组织中的表达及临床意义

申子龙 程富礼 张林锋

骨肉瘤是最常见的原发性骨癌，主要以危害儿童群体为主。在儿童中骨肉瘤发病率仅次于白血病及淋巴瘤，侵袭性骨肉瘤易出现肺转移，导致患儿不良结局。近年来外科手术技术和化疗方案的不断优化，骨肉瘤患儿预期寿命和生存质量有了很大的改善，其5年存活率可达70%～80%，但化疗药物长期应用所带来的并发症及耐药问题对患儿长期生存带来了不利的影响[1-3]。免疫疗法是近年来受到广泛关注的癌症治疗方向，微小RNA(miRNA)是一系列长度大小为18～22个核苷酸的小型非编码RNA分子，参与多种肿瘤的转录后调控过程。miR21、miR-221、miR-106a均是新发现的miRNA分子，其中miR-21被发现参与调控晚期结直肠癌、黑色素瘤及子宫内膜癌的肿瘤免疫进程[4-6]，miR-221被发现可用于原发性肝细胞癌、儿童急性淋巴细胞白血病及甲状腺的诊断及预后评估[7-9]，此外，miR-106a被证明乳腺癌、胃癌及鼻咽癌的病情判断具有一定的价值[10-12]，在骨肉瘤组织中，miR21、miR-221、miR-106a表达改变及其临床价值尚不明确，本研究通过对儿童骨肉瘤组织中miR21、miR-221、miR-106a表达改变及其与临床病理参数的关联进行分析，旨在为该病的临床诊疗及免疫靶点开发提供有价值的研究基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择本院骨科2017年3月至2020年3月收治儿童骨肉瘤患者40例作为研究对象，术中收集其病理组织，置于-80 ℃冰箱中冻存，通过电子病历调查收集研究组患者临床资料，包括性别、年龄、发病部位、Enneking临床分期及是否发生肺转移情况。纳入标准：①均经术中病理诊断为骨肉瘤。②年龄≤14周岁。③均为首次接受治疗，术前未进行化疗及其他治疗。④临床资料完整。排除标准：①监护人不同意参加研究者。②治疗中途退出研究或转院者。③治疗中途意外死亡者。选择同期医院收治的多指畸形患者20例其软骨组织作为对照组，两组对象在性别、年龄等一般资料方面比较无差异(P>0.05)。

1.2 miR-21、miR-221、miR-106a的免疫组化检测

采用免疫组化法检测miR-21、miR-221、miR-106a在组织中的表达情况，具体步骤：保存的骨肉瘤组织经常规石蜡切片后，经过烘干、脱蜡、水化、柠檬酸缓冲液抗原修复后，使用PBS缓冲液进行冲洗，滴加3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗后滴加山羊抗体进行孵育，快速甩干后滴加分别滴加miR-21、miR-221、miR-106a抗体(北京中杉金桥公司)，4 ℃孵育过夜。PBS缓冲液冲洗后向组织切片滴加二抗，37 ℃孵育30 min，采用DAB试剂盒(武汉博士德公司)显色5 min，冲洗干净后苏木精复染3min，清洗干净，梯度酒精进行脱水，二甲苯透明3 min，晾干后使用中性树胶进行封片。

1.3 结果判定

染色完成后由病理科经验丰富的医师在显微镜下对细胞染色特征进行分类，未着色细胞标记为阴性，淡黄色、棕黄色细胞为阳性标志。根据切片的阳性细胞比例及着色深度进行计分，以半定量法统计结果，视野下阳性细胞百分率判定：0分：>5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。阳性细胞着色深度判定：0分：无色或与背景色重叠，1分：浅棕黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色，将细胞阳性百分率判定得分与着色深度判定得分相乘结果为免疫组化染色评分。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 儿童骨肉瘤组织及正常软骨组织中miR-21、miR-221、miR-106a的表达比较

免疫组化分析结果表明，儿童骨肉瘤组织中miR-21、miR-221、miR-106a的相对表达显著高于正常软骨组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 儿童骨肉瘤组织及正常软骨组织中miR-21、miR-221、miR-106a的表达比较

2.2 骨肉瘤组织miR-21、miR-221、miR-106a表达与临床病理参数的关系

骨肉瘤组织miR-21、miR-221、miR-106a表达与Enneking临床分期及肺转移有关(P<0.05)，与性别、年龄及发病部位无关(P>0.05)，见表2。

表2 miR-21、miR-221、miR-106a表达与骨肉瘤临床病理参数的关系

2.3 骨肉瘤组织中miR-21、miR-221、miR-106a表达对骨肉瘤的预测价值

多元Logistic回归分析结果表明，在校正性别、年龄、发病部位和肺转移等混杂性因素后，miR-21、miR-221、miR-106a水平升高仍是骨肉瘤发病的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 骨肉瘤组织中miR-21、miR-221、miR-106a表达对骨肉瘤的预测价值

3 讨论

流行病学调查结果表明，OS在20岁以下青少年及儿童中发病率约3.2/1 000 000，其中男性发病率明显高于女性。肺转移是影响OS患儿预后的主要不利因素，发生肺转移的患儿生存率可由65%～70%降低至19%～30%，在未发生肺转移前对该病的防治较为困难[13-14]。目前研究认为OS发病原因包括表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和CAK激酶组配因子(menage a trois，MAT1)等肿瘤突变累积、年龄、性别、激素水平及辐射暴露等与OS发病存在紧密关联，而免疫因素则是导致OS发病的主要深层次原因[15-16]。

以免疫调节剂、巨噬细胞活化剂和树突状细胞治疗等为代表的免疫靶向治疗在OS中已有一定的应用，但其临床疗效不一，因此需开发新的分子靶点，用于OS的临床治疗。miRNA在体内发挥的免疫功能具有多效性，对肿瘤存在双向调控作用，且对机体对于化疗药物的敏感性存在一定的影响。miR-21主要位于染色体17q23.2上，既往研究证实了miR-21可与PTEM、TPM1、PDCD4等基因相结合的方式影响肿瘤的发展过程[17-18]。miR-221定位于X染色体P11.3上，主要通过与miR-222结合的方式影响下游免疫反应，并最终对肿瘤的增殖过程产生影响[19]。miR-106a属于miR-17家族，属于miR-106a-363基因簇中的重要致癌部分，研究发现，miR-10a可通过调控肿瘤细胞凋亡及膜转运蛋白表达的方式影响肿瘤的发展并参与肿瘤耐药过程[20]。体外实验发现，miR-21、miR-221、miR-106a mRNA在骨肉瘤细胞中水平显著上调[21-22]，本研究调查了miR-21、miR-221、miR-106a儿童骨肉瘤组织中的表达，结果显示与正常软骨组织相比，骨肉瘤组织中miR-21、miR-221、miR-106a的表达显著增加，表明miR-21、miR-221、miR-106a可能参与了儿童骨肉瘤的发病过程。本研究分析了骨肉瘤组织miR-21、miR-221、miR-106a表达与临床病理参数的关系，结果表明，miR-21、miR-221、miR-106a均在Enneking临床分期为ⅡB、Ⅲ期水平高于I、IIA期水平，而发生肺转移的骨肉瘤患者，其骨组织中miR-21、miR-221、miR-106a也明显高于未发生骨转移的骨肉瘤患者，提示miR-21、miR-221、miR-106a可能与儿童骨肉瘤的病程发展及骨转移有关。

骨肉瘤的确诊及临床分期、病理学分型等的确定需要借助病理科专业人员的帮助，存在一定的主观性，而受限于检查条件、医师水准等因素的限制，骨肉瘤诊断的不准确、不及时可能造成病情延误的问题。本研究结果证明了miR-21、miR-221、miR-106a可能参与了儿童骨肉瘤的疾病发展及转移过程，其机制有待进一步研究。