基于PTEN/AKT信号通路分析miR-128对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭作用的影响

庞俊芳 梁宗志 李 斌 黄亚鹏 张清伟

宫颈癌(cervical cancer，CC)对于女性来说是比较常见的癌症，在世界女性生殖系统恶性肿瘤的发病率排名第三。目前临床对宫颈癌的治疗主要采取手术联合铂类药物进行化疗，但没有显示出较好的治疗效果，因此，寻找新的治疗靶点和治疗方案是在宫颈癌方面的研究热点。microRNA是一类长度为18-25nt的非编码的微小RNA，广泛参与细胞的多种生物学活动，目前，已有报道证实miRNA参与宫颈癌的发病机制，对肿瘤的侵袭、转移、增殖等过程都有重要影响[1]。另外，磷酸酶及张力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)作为1种抑癌基因，有研究推测PTEN能够通过蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路调节宫颈癌细胞代谢，从而抑制肿瘤细胞的增殖及活性[2-3]。因此，本研究主要是在PTEN/AKT信号通路的基础上探讨miR-128对宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭作用的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

宫颈癌SiHa细胞由上海细胞研究所提供；miR-128-mimics和miR-128-inhibitor慢病毒构建体购自广州锐博生物科技有限公司；DMEM培养基(货号A4192101，规格500 ml)、胎牛血清(货号10099，规格100 ml)购自美国Gibco公司；DMSO试剂(货号D12345，规格10×3 ml)、TRIzol试剂(货号15596026，规格100 ml)、Lipofectamine 2000(货号11668027，规格0.75 ml)、兔源PTEN抗体(货号51-2400，规格200 μg)、兔源p-AKT抗体(货号MA5-14916，规格100 μl)、二抗羊抗兔lgG(货号A16172，规格1 mg)均购自Invitrogen公司；MTT(货号0793，规格1 g，Amresco公司)；Transwell小室(货号3413)购自Corning公司；S1000梯度PCR仪、电泳转膜设备(型号1658033)购自Bio-Rad公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养与分组 将购买的SiHa细胞用含10%胎牛血清的NMEM培养基中进行培养，保持温度为37 ℃、5%的CO2浓度、95%的空气湿度，当细胞贴壁70%～80%时进行传代培养，将处于对数生长期的细胞作为试验对象。使用Lipofectamine 2000将miR-128-mimic和miR-128-inhibitor转染至宫颈癌SiHa细胞中，分别作为观察组和阴性对照组，另外再取未处理的宫颈癌SiHa细胞作空白对照组。

1.2.2 RT-PCR技术 取观察组与阴性对照组的宫颈癌SiHa细胞，用TRIzol试剂提取SiHa细胞中的总RNA并逆转录为cDNA，用PCR仪进行检测。反应条件为95 ℃30 s(预变性)，95 ℃10 s(变性)，55 ℃30 s(退火)，70 ℃10 s(延伸)，总共循环30次。PCR反应系统以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法进行计算，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 Western Blot实验 取观察组与阴性组的宫颈癌SiHa细胞，按照蛋白提取试剂盒要求提取细胞中的总蛋白，提取完成后将其置于-80 ℃环境保存备用。蛋白样品用SDS-PAGE胶进行电泳，湿法将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在室温的条件下封闭一小时，按照说明书的方法加入一抗，PTEN抗体(1∶500)，p-AKT抗体(1∶1000)，β-action抗体(1∶1000)，4 ℃孵育过夜后加入二抗lgG(1∶5000)，室温条件下孵育一小时，显色显影，分析。

1.2.4 MTT法 将三组细胞分别接种于96孔板，每组三个平行样本，分别在接种的第1、2、3、4、5、6、7天加入MTT试剂及DMSO试剂，在490 nm下测量吸光度，观察细胞生长情况，绘制细胞生长曲线表。

1.2.5 Transwell小室法 将三组细胞悬浊液分别接种于小室的上室，把含血清的培养基放在下室，将细胞放入适宜的环境下培养48 h，取出小后用结晶紫染色，用高倍镜观察，随机抽取三处视野计算细胞数量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 宫颈癌SiHa细胞中mRNA表达水平

PCR检测结果显示，阴性组作为miR-128抑制组，阴性组宫颈癌SiHa细胞中miR-128的表达低于观察组，但阴性组的PTEN mRNA表达高于观察组，组间比较具有统计学差异，检测结果见图1。

图1 宫颈癌SiHa细胞中mRNA表达水平

2.2 宫颈癌SiHa细胞中蛋白表达水平

免疫印迹法结果显示，观察组PTEN蛋白表达量低于阴性组，p-AKT蛋白表达量高于阴性组，检测结果见图2。

图2 宫颈癌SiHa细胞中蛋白表达水平

2.3 miR-128对宫颈癌SiHa细胞增殖作用的影响

观察组和阴性对照组中SiHa细胞的增殖能力均低于空白对照组，观察组SiHa，细胞增殖能力低于阴性对照组，三组之间比较均具有统计学差异(P<0.05)，试验结果见图3。

图3 宫颈癌SiHa细胞增殖能力

2.4 miR-128对宫颈癌SiHa细胞侵袭作用的影响

观察组与阴性对照组的SiHa细胞侵袭能力均低于空白对照组，观察组侵袭能力更低，三组之间比较具有统计学差异(P<0.05)，试验结果见图4。

图4 宫颈癌SiHa细胞侵袭能力

3 讨论

宫颈癌临床常见的女性生殖系统方面产生的恶性肿瘤，在女性中发病的概率较高，进近低于乳腺癌的发病率[4-6]，严重威胁我国女性的生命安全，目前的手术治疗手段效果较差，寻找宫颈癌新的治疗靶点和治疗方法对临床治疗具有重大意义[7]。

目前已知，miRNA与宫颈癌细胞的增殖、侵袭、凋亡等生理功能密切相关，被认为是宫颈癌早期诊断治疗的新靶点[8]。例如，有研究证实过表达miR-10b能够抑制宫颈癌细胞的增殖和侵染[9]；miR-15a和miR-16能够增强宫颈癌Hela细胞的凋亡[10]；上调miR-195的表达能抑制宫颈癌细胞的迁移以及浸润[11]；miR-126的在肿瘤细胞中的表达影响患者的生存期[12]等。而miR-128在宫颈癌CC中的研究较少，现有的文献结果表明，miR-128能够促进宫颈癌CC细胞的凋亡、收敛宫颈癌CC细胞株的增殖和侵染效果[13-14]。磷酸酶及张力蛋白同系物PTEN因其具有独特的酪氨酸磷酸酶活性，被广泛的用于肿瘤的相关研究，PTEN主要通过阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤组织血管生成这几个方面影响癌细胞的发生发展，PTEN在宫颈癌方面的研究总体偏少，关于PTEN对宫颈癌细胞的影响及作用机制尚存在一些争议，但可以确定PTE能够N抑制宫颈癌细胞增殖，推测可能通过对PI3K-AKT通路的抑制作用来实现[15]。本研究就是想在PTEN/AKT通路的基础上讨论miR-128对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响。

本研究结果发现，过表达miR-128组的宫颈癌SiHa细胞中miR-128的表达量相对于抑制表达组升高，而PTEN mRNA表达量下降；经过Western Blot实验检测SiHa细胞中的蛋白表达量发现，过表达miR-128组中SiHa细胞PTEN蛋白表达水平高于阴性对照组，p-AKT表达水平高于阴性对照组。以上两个实验表明，miR-128对PTEN mRNA和蛋白的表达水平起到抑制作用，而PTEN能够负向调控PI3K/AKT信号通路，刺激AKT进行表达，增加AKT的磷酸化水平，加速新血管生成，促进细胞的增殖作用，实验结果与之前的研究结果相吻合，这里miR-128对PTEN的调控作用表明miR-128可能是潜在癌基因。但通过MTT法和Transwell小室法对miR-128对SiHa细胞的增殖作用、侵袭作用进行检测，发现过将表达miR-128组的癌细胞与正常表达的癌细胞的增殖和侵袭能力进行比较，过表达miR-128组能够减缓癌细胞的发生发展进程，这一结果与之前推测的结论相悖，而与其他关于miR-128减弱肿瘤细胞的增殖能力的结论相吻合。阴性对照组中SiHa细胞增殖与侵袭能力也低于空白对照组的SiHa细胞，可能是由于PTEN的低表达抑制了AKT的磷酸化，从而对SiHa细胞的增殖、侵袭作用起到抑制作用。本研究参考了许多文献发现miR-128和PTEN单独均可抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭，但将二者联系起来进行研究得出的结论与现存研究不相符，推测可能受其他调控因素影响，而关于二者结合的文献很少，未来可以对mir-128和PTEN在宫颈癌方面的作用机制进行深入研究，探索更多靶点。

综上所述，miR-128起到抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭作用，miR-128能够激活PTEN/AKT信号通路，但关于两者之间的相互联系及具体作用机制目前尚不明确，有待于进一步研究。