基于外周血Th17和Treg细胞探讨扫白茴风丸治疗阳虚血瘀型白癜风的作用机制

王远红，董晓仪，李慧

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省中医医院，黑龙江 哈尔滨 150036)

白癜风是一种获得性、多因性色素减退性疾病，是皮肤中黑素细胞被破坏造成的皮肤着色障碍[1]，其特征是在皮肤上出现白色斑块，并对应功能性表皮甚至是毛囊黑素细胞的丧失[2]。白癜风病因复杂，治疗手段有限且疗效参差不齐，一直是医学界急于攻克的难题。近年来，Th17、Treg细胞及其相关因子与多种自身免疫性疾病的关系逐渐引起众多学者的注意。Th17作为一种新发现的独立细胞亚群已被证实与白癜风、特异性皮炎、类风湿关节炎等疾病存在相关性，多项研究显示白癜风病灶中存在Th17的浸润[3]。外周血中调节性T细胞(Treg)的减少及其功能失调会增加对黑色素细胞的损害[4]。Treg和Th17之间具有相互转化性及相互拮抗性，两者间的动态平衡在机体自身免疫病的发生发展中具有重要作用[3]，并可为白癜风的防治提供新的理论基础。因此，本研究旨在通过对入组的白癜风患者给予中药自拟经验方扫白茴风丸，观察给药前后外周血中免疫指标的变化并揭示其潜在的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究所选的病例均来自黑龙江中医药大学附属第一医院皮肤科门诊，入选时间为2019年1月—2019年12月。根据国家卫生部《中药新药临床研究指导原则》(1993年)制定研究方案，入组时选取符合标准的18～65岁白癜风患者120例，其中治疗组、对照组各60例；另选正常组30例为黑龙江中医药大学附属第一医院健康体检者。研究过程中脱落4例、剔除3例(治疗组3例因家庭原因退出实验，对照组3例因自行更改药物剔除，1例主动退出；正常组30例无脱落、剔除)，有效病例共143例。最终57例患者采用口服中药经验方扫白茴风丸纳入治疗组，其中男性29例，女性28例，年龄19～61岁，平均年龄为(37.74±9.97)岁，平均病程为(4.77±2.63)年；对照组56例给予口服中药白癜风丸，其中男性26例，女性30例，年龄18～55岁，平均年龄为(36.61±10.01)岁，平均病程为(5.32±2.77)年。两组患者的性别、年龄、病程、临床分型等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准

西医诊断标准及白癜风分型、分期参照中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组的《黄褐斑与白癜风的诊疗标准》(2010年版)制定[5]；中医证候诊断及辨证分型标准(阳虚血瘀型)参考国家中医药管理局1994年《中医病症诊断疗效标准》制定[6]，症见：皮肤变白，或为斑片或为斑点，或伴惊惕失眠、腰膝酸软、畏寒肢冷、便溏溲清、肌肤粗糙、倦怠乏力等症状；妇女多伴月经失调；脉象多沉细，舌质多淡或边有齿痕，舌边尖有瘀点瘀斑。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①年龄在18～65岁；②符合上述诊断标准；③近1个月内无针对性治疗；④签署知情同意书并配合治疗者。

排除标准：①伴有严重原发性疾病(心血管疾病、免疫缺陷病等)；②处于妊娠、哺乳期妇女；③对治疗有关药物过敏者；④不能配合检查、调查问卷和治疗者。

1.4 中止及退出标准

①出现病情变化或加重，全身不良反应者；②由于各种原因(不配合检查、疗程中断、外出、中途改药、失访等)自行退组者。

1.5 研究方法

1.5.1 分组及治疗方法

治疗组给予口服中药经验方扫白茴风丸(由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备)，主要药物组成有：熟地黄、炙麻黄、桂枝、荆芥、防风、小茴香、百部、刺蒺藜、金银花、淫羊藿、荜拨、干姜、当归、生甘草等。服用方法：温水送服，每次6丸(0.2 g/丸)，2次/日，2个月为一疗程，连续服用4个月。

对照组给予白癜风丸(吉林省天光药业有限公司，批准文号：Z22020497)，主要成分：山药、干姜、龙胆草、蒺藜、川芎、当归、香附、桃仁、丹参、乌梢蛇、紫草、白鲜皮、补骨脂、黄芪、红花。服用方法：白癜风丸温水送服，每次6丸(0.2 g/丸)，2次/日，连续服用4个月。

1.5.2 皮损测量方法

①利用一张10 cm×10 cm的透明薄膜，设定单一最小单元1/16 cm2方格以便精确计算皮损的面积，对两组患者治疗四个月前后白斑面积进行测量，并计算组间差异；②数码相机照相法。

1.5.3 DLQI评分

根据白癜风对患者生活及心理方面的影响，分别于治疗前与治疗4个月后进行DLQI调查。

1.5.4 疗效判定标准

参照《皮肤科疾病临床评分表》中白癜风面积及其严重程度评分(vitiligo area severity index,VASI)；参照中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组的《黄褐斑与白癜风的诊疗标准》(2010年)[5]，进行临床痊愈、显效、有效、无效的判定。痊愈：白斑全部消退，恢复正常肤色。显效：白斑部分消退或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积≥50%。有效：白斑部分消退或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积≥10%、<50%。无效：白斑无变化或缩小，恢复正常肤色面积中皮损面积<10%。病情控制：白斑面积不再扩大，无新皮损出现。总有效率=(临床痊愈例数+显效例数+有效例数)/本组总病例数×100%，治疗4个月后判定疗效。

1.5.5 观察指标与实验室分析：

①标本采集：晨起取入组人员静脉血3 mL，加入EDTA抗凝管中抗凝，待检。②取抗凝全血100 μL；加入CD4-FITC 20 μL和CD25-PE 20 μL，IgG1-FITC和IgG1-PE作为同型对照；③混匀后室温避光孵育15 min；加入1 mL细胞固定/破膜液；室温避光孵育30 min，PBS洗涤两次；分别加入APC-Foxp3 10 μL、2.5 μL IL-17-PE进行胞内染色；④用PBS洗涤液洗涤重悬细胞，并用流式细胞仪检测。分析其CD25和Foxp3双阳性细胞的含量，即为Treg细胞占CD4+T细胞的百分比；分析其IL-17A阳性细胞的含量，即为Th17细胞占CD4+T细胞的百分比。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者分期、治疗前后皮损面积比较

根据VIDA评分等标准判定疾病分期，分期具有可比性(P>0.05)。治疗组治疗前后皮损面积具有统计学意义(P<0.01)；对照组治疗前后皮损面积具有统计学意义(P<0.01)；两组之间治疗后皮损面积比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 两组阳虚血瘀型白癜风患者分期、治疗前后皮损面积比较

2.2 中医证候积分比较

两组内单项评分均较治疗前有统计学意义(P<0.05)，说明两组对单项症状均可改善；两组间相比，治疗组在5个症状改善方面均优于对照组(P<0.05)，具有统计学意义；治疗前治疗组和对照组中医证候总评分经t检验，t=0.630，P=0.106(P>0.05)，说明两组总评分具有可比性；4个月后，治疗组和对照组中医证候总评分经t检验，t=-2.493，P<0.05，说明治疗组在减小中医总评分方面较对照组有效，见表2。

表2 两组阳虚血瘀型白癜风患者中医证候评分分)

2.3 两组DLQI评分比较

DLQI评分可以反映出白癜风对患者日常生活的一些不利影响，治疗前后比较评分对判断药物疗效和病情变化有一定帮助。两组患者治疗前评分经独立样本t检验(P>0.05)，两组数据具有可比性；经4个月治疗后，两组组内比较均有统计学意义(P<0.05)；两组间比较(P<0.05)，差异具有统计学意义，说明在改善患者日常生活等方面，治疗组优于对照组，见表3。

表3 两组阳虚血瘀型白癜风患者治疗前后DLQI评分比较分)

2.4 3组治疗前后外周血Treg、Th17比例比较

3组治疗前外周血Treg比例比较(P<0.01)，差异具有统计学意义；治疗组治疗前、后外周血Treg比例比较，t=-18.357，P<0.01，差异具有统计学意义；治疗前治疗组与对照组相比，t=-0.923，P>0.05，两组数据具有可比性；治疗后治疗组与对照组相比，t=10.449，P<0.01，差异具有统计学意义，见表4。

3组治疗前外周血Th17比例比较(P<0.01)，差异具有统计学意义；治疗组治疗前、后外周血Th17比例比较，t=14.927，P<0.01，差异具有统计学意义；治疗前治疗组与对照组相比，t=-1.542，P>0.05，两组数据具有可比性；治疗后治疗组与对照组相比，t=-3.066，P<0.01，差异具有统计学意义，见表4。

表4 3组外周血Treg、Th17比例比较

2.5 治疗前后疗效比较

经过4个月的治疗，两组患者病情均有不同程度改善，经秩和检验Z=-3.259，P<0.05，两组疗效有显著差异，治疗组优于对照组，见表5。

表5 两组阳虚血瘀型白癜风患者治疗后疗效对比(例)

2.6 安全性分析

在治疗期间共有3例出现不良反应，治疗组有2例患者在服药后出现胃部不适的情况，对病因排查后确定与第一次服用中药有关，嘱其餐后服药，不良反应缓解。对照组有1例患者出现头晕，对病因排查后确认与过度运动有关，休息后不良反应缓解。

3 讨论

白癜风在医学领域一直是个未攻克的难题，目前西医的诊断治疗虽已形成比较系统的体系，但是治疗效果局限，复色率较低。西医对白癜风的病因病机主要围绕自身免疫、黑素细胞自毁、神经精神因素、遗传因素等学说[1]。中医也在不断针对白癜风的病因病机进行探索，认为白癜风的发病机理多为肝郁气滞、肝肾不足、瘀血阻络[8]。笔者根据多年临床经验结合地域因素，提出白癜风患者发病的主要原因多为阳虚血瘀，“汗孔郁闭、毒邪内蕴、脉络瘀阻”是基本病机。古代医籍《素问·皮部论》中记载，大多白色症状的病变与“寒”密切相关，白癜风患者的典型皮损为白色或乳白色斑块或斑点，说明此病症与“寒”有一定的关联性[7]，而阳虚体质易感寒湿之邪。因地理因素的影响，北方属寒湿之地，故北方患者多为阳虚寒湿之型；南方虽夏季炎热，但冬季仍湿冷，阳虚寒湿之型亦多见。阳虚寒湿之体易外感风邪，致使卫阳被遏，腠理闭塞，搏于肌肤。寒邪侵袭人体又易致气血凝滞，络脉瘀阻，阳气不达，故白癜风患者易成阳虚血瘀之证[8]。笔者常用祛风托毒、补肾温阳、活血化瘀的方法进行治疗，在院内制剂“茴风丸”的基础上结合经方加味而成自拟经验方“扫白茴风丸”，在临床实践中疗效颇著。

扫白茴风丸以中医基础理论为指导，结合白癜风病因病机，具有补肾助阳，养血祛风的功效。方中麻黄、桂枝共为君药，起到发汗解表、调和营卫、疏散风邪的作用，二者在临床上常作为药对出现[9]。《神农本草经》记载麻黄治疗风寒感冒、水肿及风疹瘙痒等病，现代药理研究其具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤等作用[10]。桂枝味甘、辛，治以散寒、通阳、温经、发汗。桂枝中的挥发油等成分长于体外杀菌、抑菌、抗病毒、抗炎及免疫调节[11]。荆芥、防风在皮肤病的治疗中属于常用药对，二者配伍可治疗风疹瘙痒、疮疡初起的表证。荆芥提取物可以降低血清IgE、TNF-α、IL-6水平，荆防药对同时使用可以增强抗过敏、调节免疫、抗氧化、抗菌的作用[12]，在临床上防风、荆芥配伍的方药经常治疗各种损容性疾病，对痤疮、斑秃、白癜风、雀斑等皮肤病均有良好的疗效。淫羊藿入肾肝两经，为方中臣药，具有补肾阳、益精气、强筋骨、祛风邪的功效，对阳虚体质的白癜风患者，可以发挥补肾壮阳的作用。淫羊藿中的活性成分黄酮、生物碱、多糖、木质素等可以起到抗病毒、调节免疫、抗肿瘤、抗氧化等作用[13]。白癜风致病原因中最关键的一点则是风邪侵体，刺蒺藜有平肝阳、祛风邪的功效，在临床上治疗白癜风、瘙痒症等皮肤病疗效显著。金银花在本方中为避免温阳太过，疏散风热；金银花中的活性成分黄酮、挥发油、三萜皂类化合物、无机元素、有机化合物等可以起到抗炎、解热、止血、抗病毒、保肝、抗菌等作用[14]。百部入肺经，具有润肺祛风、杀虫止痒的功效。古文载“肺主皮毛”，治疗皮肤病可以通过肺气的宣发肃降，从而驱散外邪，使皮肤腠理致密[15]。干姜、小茴香、荜拨味辛，性热，皆入肾经，三药配伍功擅温阳发汗、补益脾肾。干姜具有抗炎、镇痛、体外抑菌的基础药理作用[16]。小茴香中的化学成分可以抗炎、抑菌、保肝利胆[17]，部分白癜风患者长期服用西药，适当口服中药可以保护肝脏，缓解副作用的刺激。扫白茴风丸中熟地黄与当归配伍可增强补益精血的功效，既达到补血的效果，又可使血脉通畅。熟地黄不仅可以改善人体的免疫功能而且还具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤的作用[18]。当归味甘、辛，性温。阳虚血瘀型白癜风患者多由气血瘀滞所致，加当归一味可入血分，补血活血，使补中有行，故有祛瘀活血之功。当归中的多糖、有机酸、挥发油可以增强人体免疫，改善血液循环[19]。甘草在中药处方中广泛应用，具有和中缓急、解毒、调和诸药的功效，防止药物产生的毒副作用损伤机体，临床常做使药使用。扫白茴风丸中运用甘草调和诸药，护胃安中，缓解其他药物药性峻烈伤及正气，且甘草在调节免疫、抗炎、抗肿瘤、解毒方面效果显著[20]。

随着病因学研究的深入，国内外许多学者已针对白癜风患者体内T淋巴细胞及其亚群进行分析。研究发现Th17、Treg细胞与白癜风发病密切相关，白癜风患者一般会伴有Th17、Treg细胞表达异常[3]。本次实验结果充分验证了这一点，并为扫白茴风丸治疗白癜风提供了免疫学依据。本研究虽对白癜风的病因病机和中医治疗方面提出了一些观点，但限于条件和观察时间较短，未能进行深入的研究与探索。今后应加大样本量进行观察，并且对患者进行长期的随访，进一步针对其作用机制深入研究。