玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立

单长林，周 圆，任 琰，季文彬，李孝军

(1.舟山海关综合技术服务中心，浙江 舟山 316021； 2.杭州海关技术中心，浙江 杭州 310000)

由密执安棒形杆菌内布拉斯加亚种(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)引起的玉米内州萎蔫病，可导致玉米产量损失高达44%[1]，是玉米病害中重要的细菌性病害，也是我国重点关注的检疫性病害之一。该病害首先在美国内布拉斯加州中部发现[2]，后逐步扩展至美国多州和加拿大部分地区[3-10]，我国尚未见报道。Cmn主要通过种子传带进行远距离传播[11-12]，且可寄生在稗属、狗尾草属、高粱属等多种植物上[13]。利用GRAP模型预测分析，结果显示，该病原物在我国大部分玉米种植区均适合定殖[14]。我国玉米产量连续多年稳定在2亿t以上，随着国内工业消费需求及饲料消费需求激增，每年仍需大量进口玉米填补国内产需缺口[15]。随着玉米进口贸易发展，Cmn传入我国风险剧增，一旦入侵，将严重威胁我国玉米生产，影响我国粮食生产安全。因此，建立并掌握一种简便、准确、快速的检测方法对于有效监控Cmn至关重要。

目前，针对Cmn的检测主要集中在传统分离培养、酶联免疫检测及常规分子生物学检测上[16-23]。分离培养及酶联免疫检测耗时较长、操作复杂且灵敏性较低，难以满足现场快速检测要求；以聚合酶链式反应为基础发展起来的分子生物学检测方法，包括普通PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR方法等，均须经过变性—退火—延伸等严格控制温度变化过程，需要特定仪器支持且反应过程耗时较长，不利于现场实验室的快速检测；环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)是目前应用比较广泛的体外恒温扩增技术，该技术利用Bst DNA 聚合酶，通过4～6条引物的链替换反应产生互补序列，实现恒温(60～65 ℃)条件下DNA扩增[24]。玉米内州萎蔫病菌LAMP检测方法[25-26]的建立，实现了恒温条件下快速检测Cmn，该方法具备特异性强、灵敏度高等优点，且通过实际样品验证，可用于现场玉米样品的检测。该方法所得产物为大小不一的条带，无法进行克隆、测序以及检测结果进一步的验证。

重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification， RAA)能有效克服这一“缺点”，该技术在恒温条件下可实现目的片段的指数级扩增，产物为单一序列条带。RAA等[27]利用细菌或真菌中提取的重组酶，通过恒温条件下重组酶与引物DNA结合成聚合体，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding， SSB)的帮助下使模板 DNA 解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的互补链，整个反应过程仅需20 min。利用RAA技术进行细菌、病毒、支原体等病原微生物[28-30]检测，具有快速、灵敏、特异等优点，是目前进行检测研究的热点。Tambong等[20]通过基因组分析等方法，筛选出纤维素酶基因部分序列可以作为靶标序列进行玉米内州萎蔫病菌的分子生物学鉴定。

本文拟通过分析比较Cmn及其近缘亚种纤维素酶基因celB序列，筛选出Cmn保守序列做为靶标序列，利用荧光RAA技术，设计并筛选引物、探针，构建玉米内州萎蔫病菌荧光RAA快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

收集近两年从舟山口岸进境的饲用玉米，共计8个样品，每个样品2 kg，样品详细信息见表 1。供试菌株共12株，其中玉米内州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)、玉米细菌性枯萎病菌菌株(Pantoea.stewartiisubsp.stewarii，Pss)为ATCC标准菌株，编号分别为ATCC 27794、ATCC 29229，为杭州海关综合技术服务中心赠送；丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.syringae，Pssy)、砖红色微杆菌 (Microbacteriumtestaceum，Mt)、密执安棍状杆菌诡谲亚种 (Clavibactermichiganensissubsp.insidiosus，Cmi)、密执安棍状杆菌密执安(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis，Cmm)、黄单胞菌(Xanthomonasoryzae，Xo)为本实验室保存；伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis，Ba)、玉米迪克氏菌(Dickeyazeae，Dz)、欧氏杆菌(Erwiniachrysanthemivar.zea，Ecz)、成团泛菌(Pantoeaagglomeran，Pag)、菠萝泛菌(Pantoeaananatis，Pan)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。

主要仪器和试剂：ABI7500型实时荧光PCR仪，美国应用生物系统公司；S002ZC型荧光RAA试剂盒，杭州众测生物技术有限公司；TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(9763型)，宝生物工程(大连)有限公司；DP320新型植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；A012型2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，GenStar-康润生物；营养琼脂培养基(CM107，NA培养基)，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与验证

利用NA培养基活化菌株(28 ℃，48 h)，接种环刮板收集菌体。按照细菌基因组DNA提取说明书提取细菌DNA，利用微量分光光度计(Nanodrop 2000)验证提取效果，-20 ℃保存备用。

1.2.2CelB序列筛选、引物探针设计与合成

从NCBI数据库中下载Cmn菌株NCPPB2581全基因组序列(序列号：HE614873)，筛选出纤维素酶基因序列，对应碱基2 525 339～2 525 973 nt，利用BLAST 分析Cmn纤维素酶基因序列与其他C.michiganensis近缘亚种间序列差异(表2)，筛选出CelB序列。

表2 试验所用基因序列

以菌株NCPPB2581全基因组序列为靶标，利用Primer premier 5.0设计引物cmn1:TGCTCGATCTTAACCGCGAC；cmn2：TACAAGCTGGACGGATCGTG，分别对应基因组2 525 241、2 525 598 nt，扩增靶标序列。反应体系为50 μL体系：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL，cmn1/cmn2(10 μmol·L-1)各2 μL，DNA模板2 μL，无菌ddH2O 19 μL。 扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序。应用MEGA6.06对测序的CelB序列C.michiganensis亚种间序列(序列信息见表2)进行多重比对，分析序列间差异。

以CelB靶标序列为模板，参照RAA引物、探针设计原理，设计正向引物 1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P，并利用Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome)与全基因数据库序列比对验证引物、探针特异性。引物、探针序列信息见表3、图1。本实验靶标序列克隆、测序，引物、探针的合成均由生物工程技术(上海)有限公司完成。

图1 多序列分析及引物、探针位置

表3 荧光RAA引物、探针

1.2.3 引物筛选与体系建立

荧光RAA检测采用试剂盒推荐反应体系和反应程序。反应体系：缓冲液A Buffer 40.9 μL，B Buffer 2.5 μL，上游引物和下游引物各2.0 μL(10 mmol·L-1)，荧光探针0.6 μL(10 mmol·L-1)，DNA模板2.0 μL。反应程序：39 ℃，30 s，共40个循环。

按照1.2.1节方法提取Cmn DNA(26.1 ng·μL-1)，以无菌 ddH2O进行10 倍等梯度稀释，梯度浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6ng·μL-1。随机选取引物组合，分别以不同浓度的Cmn DNA为模板，进行荧光RAA检测，初步探索荧光RAA对Cmn最低检测浓度。

以最低检测浓度DNA为模板，将上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物1R、2R、3R、4R组合进行荧光RAA检测，筛选出扩增效率最高的正向引物、反向引物和引物组合，将筛选出的正向引物、5F、6F、7F分别与筛选的反向引物、5R、6R、7R组合，探索扩增效率最高的引物组合，最后比较分析筛选出的引物组合，筛选出稳定性好、扩增效率高的引物组合。

1.2.4 灵敏性测定、特异性验证

利用无菌ddH2O将1.2.3节初步探索的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度。

按照1.2.1节方法提取 Cmm、Cmi、Pssy、Mt、Pss、Pan、Pag、Xo、Ba、Dz、Ecz的DNA，以11株参考菌株DNA为模板，不同浓度的Cmn DNA (Cmn-1、Cmn-2)为阳性对照，无菌 ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测，验证荧光RAA检测方法的特异性。

1.2.5 模拟样品及真实样品检测效果验证

利用无菌 ddH2O将1.2.1节收集的Cmn菌体混匀，制备菌悬液。利用涂板法，测定菌悬液浓度为5.7×105CFU·mL-1。筛选经GB/T 36840—2018：玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法[31]检测结果为阴性的乌克兰进境饲用玉米(编号1-3103304)，磨成粉状分成4份，每份10 g。将制备好的菌悬液加入研磨样品中，混匀制备成阳性模拟样品。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取4个阳性模拟样本和8个进口玉米样品DNA，进行荧光RAA检测。同时，以GB/T 36840—2018检测方法复核验证。

2 结果与分析

2.1 序列分析

以Cmn菌株 NCPPB2581纤维素酶基因序列为参考序列，经BLAST分析结果(表2)显示：纤维素酶基因部分序列(CelB序列，2 525 339～2 525 815 nt)与C.michiganensis其他亚种基因组序列的一致性仅有70%左右，相比其他纤维素酶基因序列(2 525 816～2 526 973 nt)与C.michiganensis亚种基因组序列一致性在82.46%～84.55%，Cmn菌株CelB序列差异更大，同时CelB序列在Cmn不同菌株间具有高保守性，一致性均在95%以上。故选取Cmn菌株 NCPPB2581纤维素酶基因部分序列CelB序列，对应碱基2 525 339～2 525 815 nt为目标序列进行荧光RAA引物、探针设计。

利用引物cmn1/cmn2经PCR扩增、克隆测序获取片段大小为377 bp序列。BLAST分析显示该序列与Cmn序列NCPPB 2581(登录号：HE614873)、61-1(登录号：CP033723)、7580(登录号：CP033722)、HF4(登录号：CP033721)一致性100%，与C.michiganensis近似亚种(Cmi，Cmm，Cmc，Cms)一致性不到 70%。利用MEGA 6.06对测序靶标序列与表2中C.michiganensis亚种基因组序列进行比对分析，结果(图1)显示，测序靶标序列中的CelB序列(部分)在不同株系Cmn中具有高保守性，与近缘亚种间存在明显基因位点差异，可以作为鉴定Cmn的特异性序列片段。

将设计的荧光RAA探针P序列经Primer-Blast与全数据库序列比对，分析显示探针P对Cmn菌株NCPPB 2581(登录号：HE614873)、61-1(登录号：CP033723)、7580(登录号：CP033722)、HF4(登录号：CP033721)识别率和覆盖率均为100%，对数据库其他序列数据无识别现象；将设计的正向引物 1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F和反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R组合分别与数据库序列比对，分析结果显示，所有引物组合均对Cmn菌株NCPPB 2581(登录号：HE614873)、61-1(登录号：CP033723)、7580(登录号：CP033722)、HF4(登录号：CP033721)100%识别。例如引物1F、1R分别对应菌株NCPPB 2581(登录号：HE614873)2 525 335、2 525 547 nt，对应菌株7580(登录号：CP033722)252 5691、2 525 903 nt，对应菌株61-1(登录号：CP033723)2 525 698、2 525 910 nt，对应菌株HF4(登录号：CP033721)2 526 093、2 526 305 nt，产物大小均为213 bp，对其他序列数据无识别现象；引物2F、6R分别对应菌株NCPPB 2581(登录号：HE614873)2 525 342、2 525 585 nt，对应菌株7580(登录号：CP033722)2 525 696、2 525 939 nt，对应菌株61-1(登录号：CP033723)2 525 703、2 525 946 nt，对应菌株HF4(登录号：CP033721)2 526 098、2 526 341 nt，产物大小均为244 bp，对其他序列数据无识别现象。

2.2 荧光RAA体系建立

选取引物组合1F/1R，分别以不同浓度的Cmn DNA进行荧光RAA检测，结果(图2-A)显示浓度为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4ng·μL-1的Cmn DNA，经荧光RAA检测均呈现典型的扩增曲线，而浓度为2.6×10-5ng·μL-1的Cmn未有扩增曲线。故，以引物组合1F/1R的荧光RAA最低检测浓度为2.6×10-4ng·μL-1。

以浓度为2.6×10-4ng·μL-1的Cmn DNA为模板，上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物R1、R2、R3、R4组合，分别进行荧光RAA检测，结果(图2-A)显示：同一反向引物与不同正向引物组合中，与引物2F组合的扩增效率比与1F、3F、4F组合的扩增效率都高，例：引物2F/1R荧光RAA 40循环相对荧光强度△Rn为339 522.9，远大于1F/1R(△Rn=248 390.3)、3F/1R(△Rn=153 493.6)、4F/1R(△Rn=293 477.5)，故选取2F作为最佳正向引物；同一正向引物与不同反向引物组合中，没有唯一反向引物在与正向引物组合中扩增效率均为最高，例：与1F组合效率最高的是1R(△Rn=248 390.3)，与2F组合效率最高的是3R(△Rn=465 121.7)，与3F组合效率最高的是4R(△Rn=275 858.6)，与4F组合效率最高的是3R(△Rn=349 036.5)，但反向引物4R与不同正向引物组合扩增效率表现最稳定，故选取4R作为最佳反向引物；考虑引物组合扩增效率，2F/3R(△Rn=465121.7)、2F/4R(△Rn=405 603.0)引物组合扩增效率最高。

将正向引物2F、5F、6F、7F分别与4R、5R、6R、7R组合，2.6×10-4ng·μL-1的Cmn DNA为模板进行荧光RAA检测，结果(图2-B)显示，2F/6R(△Rn=282 768.9)组合扩增效率远远大于其他引物组合扩增效率。分别以引物组合2F/3R、2F/4R、2F/6R进行荧光RAA检测实验，每个样本重复4次，分析比较不同引物组合的扩增效率及稳定性。结果(图2-C)表明：引物组合2F/6R(△Rn=314 051.0)扩增效率高于引物组合2F/3R(△Rn=141 673.0)、2F/4R(△Rn=240 258.5)，表现稳定。故最终选取引物组合2F/6R与探针P，建立玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。

A，正向引物1F，2F，3F，4F与 1R，2R，3R，4R组合40循环后相对荧光强度；B，正向引物2F，5F，6F，7F与 4R，5R，6R，7R组合40循环后相对荧光强度；C，正向引物2F与3R，4R，6R组合40循环后相对荧光强度。

A，引物1F/1R 荧光RAA最低检测浓度初测结果；B，引物2F/6R荧光RAA灵敏性检测结果。E0～E7的DNA浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6 ng·μL-1；N为阴性对照。

2.3 灵敏性及特异性测定

利用灭菌 ddH2O，将浓度为 2.6×10-4ng·μL-1(261 fg·μL-1)的Cmn DNA 2倍等梯度稀释成浓度为130、65 fg·μL-1。以3种浓度的DNA为模板，每个浓度5个重复，并以无菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测。结果显示(图3-B)：荧光RAA检测方法可检测浓度为261、130 fg·μL-1的样品，而浓度为65 fg·μL-1的5个重复中，有3个重复40个循环后检测到只有不到20 000的相对荧光强度，而另外2个则没有检测到有效强度荧光信号，证明荧光RAA方法不能有效检测浓度为65 fg·μL-1的样本。故，建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法的灵敏度为130 fg·μL-1，比引物1F/1R组合的荧光RAA灵敏度提高2倍，比实验室建立的LAMP检测方法50 fg灵敏度稍低[25]。

1～11，玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞杆菌番茄致病变种、砖红色微杆菌、密执安棍状杆菌诡谲亚种、密执安棍状杆菌密执安、成团泛菌、菠萝泛菌、黄单胞菌、伯克霍尔德氏菌、玉米迪克氏菌、欧氏杆菌；N，无菌ddH2O；Cmn-1，浓度为26.1 ng·μL-1 Cmn基因组；Cmn-2，浓度为1.3×10-4ng·μL-1 Cmn基因组。

利用2株C.michiganensis近缘亚种菌株(Cmi、Cmm)和9株其他菌株(Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz )，并以DNA浓度分别为26.1、130 fg·μL-1的Cmn样本(编号：Cmn-1、Cmn-2)为阳性对照，无菌 ddH2O为阴性对照，验证以引物2F/6R、探针 P 组合建立的荧光RAA检测体系的特异性。结果(图4)显示，荧光RAA能够检测出两种不同DNA浓度的Cmn样品Cmn-1、Cmn-2，未检出包括Cmi、Cmm内的其他11株菌株。表明以引物 2F6R和探针P组合的荧光RAA检测体系可以特异检出Cmn。

2.4 模拟样本及真实样品检测效果

将制备好的玉米内州萎蔫病菌阳性模拟样本(4份)与进境玉米样本(8份)，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行荧光RAA检测，同时用GB/T 36840—2018《玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法》验证。结果(表1)显示，2种方法均检出4份模拟样本，均未检出8份进境玉米样本，与标准方法GB/T 36840—2018检测结果一致。本研究结果证实，新建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法可用于玉米种子样本的检测。

3 讨论

玉米内州萎蔫病是继玉米幼苗枯萎病、玉米大斑病后的美国第三大玉米病害，仅2012—2015年间，在美国及加拿大安大略地区该病害造成多达1 360万t的玉米产量损失[31]。经最新评估显示玉米种子传毒率高达0.005%[12]，且病原物寄主广泛，包括高粱、甘蔗、苏丹草、黑麦草、假高粱、马唐、狐尾草、狗尾草等均可作为其替代寄主[13]。随着玉米内州萎蔫病在美国主要玉米产区的扩散，该病害随美国进境玉米传入中国的风险日益剧增。分子生物学方法是检测该病原物的重要手段，靶标序列的选择至关重要。叶露飞等[18]依据内州萎蔫病菌及其近缘亚种16S-23S序列差异建立的PCR检测方法，封立平等[19]依据ITS基因序列差异位点建立的巢氏PCR检测方法，McNally等[21]依据CMN_01184序列建立的普通PCR和qPCR检测方法，Adriana等[22]和Tambong等[20]通过对玉米内州萎蔫病菌及其近缘亚种全基因组序列分析，分别筛选出MSF转运体和纤维素酶基因部分序列作为靶标序列，建立了多重实时荧光PCR检测方法和普通实时荧光PCR检测方法。本试验通过对玉米内州萎蔫病菌纤维素酶基因BLAST分析，筛选出CelB特异性序列，并利用Mega进行多序列比对分析，筛选差异性基因位点，设计荧光RAA引物、探针，成功建立了针对玉米内州萎蔫病菌的荧光RAA检测方法。

与传统分子生物学检测方法相比，新建立的荧光RAA检测方法实现体外恒温扩增，荧光RAA检测在39 ℃恒温条件下，便可完成特定片段的指数级扩增且灵敏度高达130 fg·μL-1；与LAMP检测方法相比，荧光RAA检测既有恒温、灵敏、特异的优势，同时更简便、更快速，RAA只需用一对引物，可在20 min内实现特定片段的扩增，且产物为单一条带。通过与荧光探针的结合，RAA技术可实现扩增过程的动态监控，进行定量检测。本研究尝试利用模板DNA 10倍梯度稀释液进行荧光RAA定量检测研究，以模板LOG浓度为横坐标、相对荧光强度△Rn>20 000的循环数为纵坐标建立标准曲线，显示：当选取样本浓度为26.1、2.6、2.6×10-1ng·μL-1的数据进行拟合标准曲线，可得y=-3.5x+21.792(R2=0.993 2)，但随着选取样本浓度的降低，拟合的标准曲线可信度R2<0.95，分析原因或与模板梯度稀释不够均匀有关，有必要制备标准质粒进行荧光RAA定量检测研究。