家兔股骨植入可降解型镁合金加压螺钉的生物效应与抗菌性能研究

王照华，杨 越，徐景超，张雁儒

（河南理工大学医学院1，骨科研究所2，河南 焦作 454000）

镁合金是因骨折而进行的骨修复中常见的骨支架材料。骨支架对骨折的康复发挥协同作用，而最理想的支架材料应能在术后初期发挥其机械特性，起到固定支撑骨组织的作用，待骨组织愈合后可逐渐自行降解和消失[1]。骨支架材料一般分为生物降解型和非生物降解型，传统的非生物降解型的骨支架仅能支持骨组织，维持其形态。其优点在于耐磨损、韧性高、稳定性强。但存在需要二次手术取出的情况，增加了患者痛苦与经济负担。目前，降解型材料是主要的生物材料发展方向，镁合金作为一种新型生物植入材料，与人体有较高的生物相容性，且容易降解[2]。镁离子是人体必需的常量元素[3]，但其也有韧性较差、降解过快等风险性。目前对镁合金生物材料的研究大多倾向于降解过程、生物安全性、生物力学等方向，而对其于骨生长的影响与抗菌性能研究较少[4]。可吸收性镁合金植入物在生物体内的应用效果与抗菌性能仍需探究。故本研究以家兔为研究对象设计实验，植入新型可降解镁合金螺钉，观察其降解效果与抗菌性能，探究其生物安全性以及对骨生长的影响，旨在为新型可降解镁合金植入物在临床方面的选择与应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 健康白色成年新西兰家兔20只，雌雄不拘，体质量4.1～4.8 kg，体温38.5 ℃～39.5 ℃，由河南理工大学医学院实验动物房提供。饲育室室温（20±3）℃，相对湿度50%～60%，昼夜光照节律12 h∶12 h，兔粮食用量为400～500 g/d，自由饮食水。对实验动物的处理与实验目的符合人类的道德伦理标准和国际惯例，符合3R 规则。细菌菌株：感染动物所用细菌由河南理工大学病原生物实验室提供的金黄色葡萄球菌菌液（S.aureus）（1×1011/L）。新型可降解镁合金螺钉：植入体内的兔用新型可降解镁合金螺钉由焦作市新港医疗设备有限公司提供，主要材料：Mg3Zn1Ag。病理切片相关仪器与试剂：BQ-318D 石蜡切片机（湖北伯纳医疗科技有限公司）、HS-1145病理组织漂烘仪（金华市华速科技有限公司）、Bx53荧光倒置显微镜[奥林巴斯（深圳）工业有限公司]、组织包埋盒、冰醋酸、甲醛、二甲苯、石蜡、乙醇（50%、75%、95%、无水乙醇）、水杨酸脱钙液（盐酸8 ml，醋酸5 ml 和水杨酸10 g）。手术器械及药品：兔盒、兔用解剖台、常用手术器械、克氏针、骨钻、生理盐水、10%水合氯醛、碘伏。金黄色葡萄球菌检测：常用菌种接种器械、梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（上海博微生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 镁合金加压螺钉的植入 将健康成年家兔随机分为对照组与实验组，各10 只。于术前禁食3 d，捉拿称重后经兔盒固定后用10%水合氯醛溶液以2 ml/kg 的剂量，经耳缘静脉处注射进行麻醉处理。待其角膜反射与疼痛反射消失后对手术部位进行脱毛处理，俯卧位固定于消毒后的兔用解剖台。术者洗手穿戴手术服，对手术部位及周围用碘伏擦拭消毒，加盖手术铺巾并用布巾钳固定。在体表可扪及大转子处沿股骨向下方处做一长约2 cm 切口。用手术刀切开皮层与肌肉层直至股骨，组织钳固定皮层并扩开创口后，用止血钳游离周围肌肉。完全暴露出骨干，经生理盐水冲洗后用克氏针选择骨干粗壮处钻孔定位，再经骨钻扩孔后向骨髓腔内注射金黄色葡萄球菌液0.5 ml（1×1011/L）并加压拧入镁合金螺钉。冲洗并缝合创口。待清醒后术侧活动无障碍、精神状态良好、进食正常即为手术成功，见图1。对照组实验家兔行相同手术处理，不植入加压螺钉。术后家兔实施单笼饲养，正常术后护理[5]。

图1 镁合金加压螺钉的植入手术

1.2.2 镁合金螺钉的影像学检测 分别于术后30、60 d 对术侧进行X 射线影像学观察。

1.2.3 骨组织切片观察 术后60 d，实验家兔空气栓塞法处死。解剖取其完整股骨，剔除肌肉组织观察。之后用咬骨钳截取需要部位。放入固定液中固定后再经水杨酸脱钙液脱钙处理-除酸-梯度乙醇脱水-二甲苯透明-石蜡—二甲苯混合液浸透-液态石蜡浸透的步骤，即可进行包埋切片[6]。选取完整的切片进行漂片与摊片，将玻片烘片处理后经逆梯度乙醇置水，再经蒸馏水冲洗后以此进行苏木素染色-冲洗-伊红染色-冲洗-梯度酒精脱水-二甲苯透明的步骤，最后滴加中性树脂封片，制作成功后后使用倒置显微镜进行观察[7]。

1.2.4 金黄色葡萄球菌检测 处死后于无菌环境下取手术部位周围分泌物及部分组织，进行细菌培养，经药敏分析系统鉴定金黄色葡萄球菌是否存在。

1.3 观察指标 ①影像学：观察螺钉是否固定良好，周围有无骨坏死，螺钉在植入期间有无缓慢降解；②股骨大体解剖观察：周围肌肉组织与骨髓腔是否出现炎症，螺钉是否降解完全，有无膨大骨痂；③组织切片观察：有无成骨细胞、坏死骨细胞，骨细胞排列形态，骨小梁形态；④金黄色葡萄球菌检测：两组分别取手术部位分泌物及组织培养后进行金黄色葡萄球菌检测，比较两组阴性率。

2 结果

2.1 影像学检测结果 术后30、60 d 的影像学检测结果发现，30 d 时可见螺钉已出现腐蚀，X 光片可见其螺纹模糊、螺钉直径变小，但固定良好。且周围骨组织无病变、坏死、塌陷等不良反应。60 d 时已不可见螺钉，但可观察到创口愈合后的骨痂。且周围骨组织无病变无坏死，未有骨质疏松样症状，见图2。

图2 术后X 光摄像

2.2 股骨形态、HE 切片结果 实验家兔活动正常，未见术侧异常、萎缩等症状。离体股骨经肉眼观察可见原植入螺钉处螺钉已完全降解。原螺钉植入处的骨组织增生，伤口愈合并形成膨大的骨痂，周围肌肉组织无炎症反应见图3；组织切片观察：对膨大的骨痂部位包埋切片后行HE 染色处理，于显微镜下放大40 倍可见骨细胞与成骨细胞迅速增长，细胞至无序排列，见图4。与对照组相比，成骨细胞较多，且细胞排列更具有无序性，缺少细胞的有序性与致密性，植入物被成骨细胞填充，无坏死骨细胞，见图5。

图3 术后股骨形态

图4 植入螺钉处经HE 染色骨切片显微观察

图5 对照组骨切片经HE 染色

2.3 细菌种类鉴定 实验组金黄色葡萄球菌阴性率为90.00%。对照组金黄色葡萄球菌阴性率为20.00%，证明镁合金螺钉具有一定的抗菌效应。

表1 金黄色葡萄球菌检测结果

3 讨论

目前大量的实验研究已经证明镁合金植入物生物兼容性强、降解完全，是较为安全的生物材料[8]，而在目前的骨科植入物的研究中，医用金属材料仍被广泛用于骨折固定。研究发现，传统金属材料存在不锈钢中的镍离子可导致机体出现过敏性皮炎等症状的不足，钴合金中的钴镍元素具有致敏性，钛合金中的钒摄入体内会导致机体血压的变化等[9]。一些固定材料需二次手术取出，增加患者痛苦。故镁合金作为生物材料受到广大研究人员的关注。但镁合金材料公认的缺点在于韧性较差，降解速度过快，降解不完全[10]。本实验家兔进行的日常活动中未出现术侧异常、萎缩等不良反应。影像学观察发现，螺钉逐渐降解，周围骨组织未有骨质疏松样症状。证明新型可降解镁合螺钉降解速度合理，降解完全。表明其相较于传统加有抗菌涂层的钛合金植入物相比，具有更加优良的生物安全性，且避免二次手术[11]。

本次实验观察实验组家兔股骨组织切片发现：植入镁合金螺钉的部位成骨细胞增加，骨组织排列无序，相对于对照组骨细胞生长速度较快，证明其对骨生长与骨愈合具有一定的促进作用。有学者表明其原因在于镁离子是人体含量第2 位的阳离子，且半数以上的阳离子存在于骨组织中，其缺失可导致血钙降低，易导致骨质疏松，镁离子对于内环境稳态的维持也起到重要作用[12]。既往研究显示，骨组织中富镁环境下可刺激骨生成、提高细胞黏附率、抑制破骨细胞等作用。镁离子能够通过多个信号通路影响骨代谢，促进新骨的形成从而刺激骨折愈合。镁离子促骨生长机制与抗菌机制相协同，促进手术部位骨组织的愈合且有效降低了术后骨髓炎等潜在风险，表明其更适宜作为髓内植入物所使用。

王湛等[13]经体内植入镁合金材料实验探究发现，对于新型镁合金材料植入物在植入体内对于革兰阴性菌——大肠杆菌、革兰阳性菌——金黄色葡萄球菌有明显的抗菌作用。而在体外实验中也具有较好的抗菌性能。本实验中金黄色葡萄球菌菌种检测发现，实验组金黄色葡萄球菌阴性率为90.00%，且髓腔内无骨髓炎并发，而对照组金黄色葡萄球菌阴性率为20.00%，表明新型可降解型镁合金材料具有一定的抗菌性。其机制可能在于镁降解产生的OH-表现为碱性，导致局部pH 的增高，而细菌的最佳生长pH 为7.4～7.6[14]。从pH 的方向抑制了细菌的生长，达到了抗菌的作用有关。另有学者认为镁离子的抑菌性能在于细菌胞膜外高浓度的金属阳离子破坏了原内外离子浓度差，形成新的内外浓度差，从而阻碍一些细胞生长物质的转运。并且金属离子可能存在有使细胞内酶失活的作用，从而影响细胞的正常生化反应[15]，但具体原因尚不明确。

综上所述，新型可降解型镁合金材料在家兔体内具有较高的生物安全性，排异反应小的同时又具备了优良的抗菌性能，有效抑制金黄色葡萄球菌，减少了骨髓炎、术后感染等潜在风险。但目前对于镁合金材料抗菌性能的临床研究仍较少，仍有待于对镁合金植入物的非细胞毒性与镁离子的具体生化反应进行研究，并评估其临床上的生物效应。