类风湿关节炎中医古籍研究及网络药理分析※

申安平 王炳森 李 桓 李松伟

(河南中医药大学2019级硕士研究生，河南 郑州 450000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以累及四肢小关节为主的自身免疫性关节疾病，发病率高，致残性较大，易合并多种疾病(如肺间质纤维化、干燥综合征等)[1-2]。现代医学治疗RA主要以改善临床症状，延缓病情进展为主，然而其骨髓抑制及胃肠道不适等副作用导致患者依从性不高。

RA属中医学“痹证”范畴，《素问·痹论》将其分为“痛痹”“行痹”“着痹”。随着对痹证认识的不断发展，人们已逐渐完善其病因病机，形成了活血为主兼健脾化痰、滋补肝肾等疗法[3-5]。随着现代化的不断发展，中医药的研究也逐渐与当今主流信息技术相结合，并在用药规律、名老中医经验传承及药理研究开发等方面取得了重要的成果[6-8]。基于此，本研究运用现代信息技术对古代中医痹证用药规律进行研究总结，以期发现其用药规律和配伍特点，并通过构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络模型，阐释其治疗RA的具体机制，为临床中药治疗RA提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据收集 在《中华医典》中搜索“痹证”“痹病”“痹痛”“痛痹”“历节”“鹤膝风”等关键词，共检索到1456首方剂。

1.2 纳入标准 治疗上具有完整的功能主治，并且组方完整的方剂。

1.3 排除标准 ①具体组方药物相同，但方剂名称不同；②摘选同一方书，方剂名称相同、主治相同，但药味较少的方剂；③明确用于外敷的方剂。

1.4 数据预处理 共收集585首方剂，将上述方剂以0和1的方式输入Excel表中，建立中药数据库。对药物的名称和分类按照《中华人民共和国药典》2015年版进行规范统一。

1.5 数据分析 使用SPSS Statistics 26软件对纳入的药物进行统计描述及系统聚类，采用SPSS Modeler 18.0中的Apriori建模进行关联规则分析。

1.6 成分及靶点的收集 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库筛选得到当归-川芎的活性成分[9]，整理TCMSP、瑞士靶点预测数据库(Swiss Target Prediction)、人类基因和网络功能分析数据库(GenCLiP 3.0)中的药物疾病靶点[10]，用Venny平台进行药物和疾病靶点映射，获得当归-川芎治疗RA的作用靶点。

1.7 通路富集分析及模型构建 将上述作用靶点导入注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)中[11]，获得富集通路，运用功能蛋白协作网络(STRING)数据库和Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-通路”模型和蛋白互作模型[12]。

1.8 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路可视化 将作用靶点导入DAVID数据库KEGG模块中，选择Search&Color Pathway功能，导出整合并可视化相关通路。

2 结果

2.1 药物使用情况 将585首方剂中出现的中药进行排序，共出现中药156味，累计出现6165次。其中出现频数≥50次的药物共34种(总频数3656次)，排名靠前的为当归263次(7.19%)、防风203次(5.55%)、羌活179次(4.90%)、川芎175次(4.79%)。依据《中华人民共和国药典》2015版将药物规范化后，将高频药物(≥50次)进行分类，使用较多的为解表和活血化瘀药。使用频数≥50次的药物见表1，药物分类见图1。

图1 药物分类

表1 使用频数≥50次药物

2.2 高频药物系统聚类分析 采用SPSS Statistics 26软件对高频药物(≥50次)进行系统聚类，由图可知，其中1类为当归-川芎，2类为防风-羌活，聚类分析树状图见图2。

图2 聚类分析树状图

2.3 高频药物关联分析 采用SPSS Modeler 18.0软件对高频药物(≥50次)进行关联规则分析，选择Apriori建模得出药物之间的配伍关系，设定支持度>10%，置信度>70%，获得核心药对10个，有当归-川芎、牛膝-杜仲等。见表2。

表2 高频药物的关联表

2.4 成分及靶点的收集 在TCMSP数据库中设定口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18筛选得到当归-川芎的活性成分9个。整理TCMSP、Swiss Target Prediction、GenCLiP 3.0数据库中靶点后获得9个治疗RA的作用靶点，具体成分见表3。

表3 当归-川芎的主要活性成分及其OB和DL值

2.5 蛋白互作模型构建 将当归-川芎治疗RA的9个作用靶点导入String数据库中获得蛋白互作网络，并在Cytoscape软件中可视化。图中前3位的靶点蛋白主要为STAT3、JUN、MAPK14，该网络提示当归-川芎的作用靶点在治疗RA过程中存在着相互协同，而靶点的相互协同恰恰可能是当归-川芎增强治疗的作用机制。见图3。

2.6 富集通路分析 KEGG结果显示当归-川芎的富集通路主要在肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、B细胞受体信号等通路上，结果表明当归-川芎的作用靶点富集在多个通路内，并可通过协调多条通路来发挥治疗RA的作用。见图4。

图4 KEGG富集通路图

2.7 “药物-成分-靶点-通路-疾病”网络模型构建 将上述数据导入Cytoscape软件中进行可视化，结果表明当归-川芎的9个活性成分与作用靶点有关联的共7个，活性成分排名较前的为β-谷甾醇、杨梅酮，靶点排名较前的为PTGS2、PIK3D、MAPK14，主要的通路为TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、VEGF信号通路。见图5。

图5 药物-成分-靶点-通路-疾病图

2.8 通路的可视化 将当归-川芎的9个作用靶点导入KEGG数据库中进行通路可视化，图中描述了TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、VEGF等信号通路分布情况，结果表明作用靶点大多集中在发挥功效的关键之处。见图6。

图6 部分KEGG通路富集结果

3 讨论

RA早期的病理改变主要为滑膜炎及血管翳的形成，晚期常会导致四肢关节的肿胀、侵蚀[13]。RA属中医学“痹证”范畴，痹者，闭塞不通也，其病名最早可追溯至《内经》[14]。中医学认为，痹证为感受淫毒邪气, 或劳倦、情志失调导致脏腑、气血、阴阳失衡所致。痹证日久则形成瘀滞痰停、肝肾亏虚之证，治法常以活血化瘀兼补肝肾为主。中医在痹证治疗方面经验丰富，对RA的认识和治疗也具有其独特的优势，然而目前传统中医药治疗RA的用药规律和具体机制尚不清楚。现代信息技术具有大数据分析处理和药物分子对接能力，因此借助这一特性可以系统了解其治疗RA的用药规律和作用机制。

本研究统计发现古代痹证的治疗中使用频数较多的药物为当归、防风、羌活、川芎等，运用最多的药物类别是解表药、活血化瘀药和补虚药，聚类分析树状图可以分为当归-川芎、防风-羌活等几类。提示在RA的辨证中要考虑是否合并血瘀证和风寒表证，治疗中可适当多选用当归-川芎、防风-羌活等药对。其次，本研究还发现在临床用药选择方面，除祛风解表、活血化瘀药外，多随证配伍祛风湿、补虚类药物，提示RA治法着重祛风解表、活血化瘀，兼顾祛风湿、补肝肾。

Modeler关联分析发现古方关联度较强的药对有10对，提示临床用药时应注重当归、川芎、羌活、防风等药物之间的配伍。从关联度较强的药对组合当归-牛膝-川芎(活血化瘀药-活血化瘀药-活血化瘀药)、牛膝-杜仲-当归(活血化瘀药-补虚药-活血化瘀药)可以看出，对于RA的研究未来应注重从活血化瘀和补肝肾等相互配伍进行研究。

本研究通过设定OB和DL值筛选得到当归-川芎9个活性成分，在与药物疾病靶点映射后共获得9个治疗靶点，最终富集分析当归-川芎中治疗RA的通路机制主要有9条。RA作为免疫炎性疾病，主要致病炎症因子为TNF因子，通过阻断TNF信号通路，可以减轻TNF炎症因子引起的血管和关节的损害[15]，临床TNF拮抗剂证实有效[16-17]。JAK-STAT信号通路是人体内为数不多的炎症调节通路，在免疫和炎症过程中具有重要意义[18-19]，该通路主要通过提高基质金属蛋白酶的表达从而造成RA的持续滑膜炎，因此调节该通路可能达到治疗RA 的作用[20]，当归、川芎很可能通过靶点JAK1、JAK2干预JAK-STAT信号通路进而治疗RA。VEGF信号通路与滑膜血管生成有关，成为近年来治疗RA的热点通路[21-22]，众多的基础实验表明通过调节VEGF信号通路治疗RA是一个可行之法[23-24]，当归-川芎靶点在本通路的富集，表明其通过调节VEGF信号通路治疗RA的潜力。此外，当归-川芎还可能通过调节B细胞受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等发挥治疗作用。上述结果表明，中药治疗RA是多成分、多靶点、多通路过程，在生物制剂时代仍具有不可忽视的治疗前景。

本研究通过分析古代中医治疗痹证的方剂，总结了传统中药治疗RA用药规律及其潜在药理机制，为RA临床辨证治疗提供了思路和依据，为开发治疗RA的药物提供了一些新的启发。但本研究药理分析部分主要基于信息技术来进行数据的挖掘预测，因此结果具有一定的局限性，下一步我们就网络药理学的预测结果开展相关实验研究，进一步明确当归-川芎治疗RA的机制。