降糖三黄片急性及长期毒性研究

王保华，郭起岳，刘月姝，白建瑜，朱章志，李赛美*

(1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广东省医学实验动物中心，广东 佛山 528248)

降糖三黄片是广州中医药大学第一附属医院中药复方院内制剂，由桃仁、桂枝、大黄、芒硝、黄芪、生地黄、麦冬、玄参、炙甘草组成，具有泻热逐瘀，益气养阴的功效，用于治疗2型糖尿病及慢性并发症[1-5]，临床疗效明确。为新药研发及临床用药提供安全性评价依据，本研究对降糖三黄片急性毒性及长期反复用药的蓄积毒性反应、剂量毒性效应关系、毒性靶器官及可逆性进行实验研究。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠，6～7周龄，雌雄各半，体质量100～118 g，购买及饲养于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，适应性喂养7 d后开始实验。

1.2 药物

降糖三黄片(粤药制字：Z20071185，批号：20150301)，广州中医药大学第一附属医院制剂中心生产。

1.3 仪器

全自动血细胞生化分析仪，日本HITACHI；Multiskan GO全波长酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific；KJ8A1直接检眼镜，苏州康捷医疗器械有限公司；ASP300S全自动脱水机，德国LEICA；EG1150生物组织包埋机，德国LEICA；RM2235轮转切片机，德国LEICA；HI1210摊片机，德国LEICA；HI1220烘片机，德国LEICA；AutoStainer-XL自动染色机，德国LEICA；BX43型生物显微镜，日本OLYMPUS。

2 方法

2.1 急性毒性试验

SPF级SD大鼠，雌雄各半，随机分为正常对照组和降糖三黄片组，每组20只。禁食不禁水约16 h后称重，1日3次灌胃给药最大允许浓度(0.6 g/mL)和剂量(20 mL/kg)的降糖三黄片混悬液，即给药量为36 g·kg-1·d-1，相当于临床最大拟用药量的288倍。对照组给予等体积的去离子水。连续14 d观察大鼠外观、行为活动、呼吸、摄食摄水量、排便、死亡等情况。

2.2 长期毒性试验

2.2.1 动物分组与药物剂量选择

SPF级SD大鼠208只，雌雄各半，随机分为对照组、降糖三黄片低(临床剂量8倍，1 g·kg-1·d-1)、中(临床剂量24倍，3 g·kg-1·d-1)、高剂量组(临床剂量72倍，9 g·kg-1·d-1)，48只/组，按性别分笼饲养。每天1次灌胃降糖三黄片混悬液，对照组给予等体积的去离子水，连续6个月。每周称重，跟据体质量变化及时调整给药量，恢复期观察28 d。

2.2.2 观察指标

每天观察大鼠精神状态、行为活动等一般情况及其他毒性症状；计算摄食量与摄水量；给药前及给药后每周对大鼠进行称重；实验中期(给药3个月)、实验末期(6个月)及恢复期(停药1个月)，每组各取总数的1/3大鼠，硫酸阿托品散瞳后进行眼科检查；代谢笼采集24 h尿液进行尿量计算及分析；麻醉后腹主动脉取血，制备全血及血清标本，分别进行血常规及生化指标检测；解剖取脏器、称重，计算脏器系数，心、肝、肾等脏器于4%多聚甲醛固定，包埋，切片及HE染色后进行组织病理学检查。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 降糖三黄片急性毒性试验结果

给药期间连续观察14 d，大鼠一般状况、自主活动、体表完好，生理腔道未见异常分泌物。试验结束后各组无大鼠死亡，未见明显毒性反应症状，解剖后脑、心脏、肝脏、脾脏等主要器官未发现异常。大鼠摄食摄水量、体质量增长无异常，降糖三黄片低、中、高剂量组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2 降糖三黄片长期毒性试验结果

3.2.1 降糖三黄片对大鼠一般状况的影响

试验期间，各组大鼠精神状态、外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸均无异常，无毒性症状出现。各组大鼠均无死亡，停药后各项观察指标均未见异常改变。

3.2.2 降糖三黄片对各组大鼠摄食、摄水量和体质量的影响

试验期间各组大鼠饮食正常，摄食、摄水量无差异，尿量及尿常规检查无异常，给药组个别大鼠出现大便偏软，但停药后24 h即恢复正常，均未出现腹泻症状。与对照组相比，降糖三黄片各组大鼠体质量增长变化无统计学意义(P>0.05)，结果见表1。

3.2.3 降糖三黄片对大鼠眼科检查的影响

眼科检查表明，给药3个月、6个月及停药1个月各组大鼠眼眶、眼睑、眼球、瞳孔、角膜、视网膜、视神经乳头等无异常。

表1 降糖三黄片对大鼠体质量影响

3.2.4 降糖三黄片对大鼠血常规、凝血功能及生化指标的影响

与对照组相比，各组大鼠在给药3个月、6个月及停药1个月的血常规、凝血功能、血糖、甘油三酯、胆固醇、血清钠离子差异无统计学意义(P>0.05)；给药3个月的降糖三黄片中、高剂量组大鼠血清钾离子和给药6个月的降糖三黄片中剂量组大鼠血清氯离子偏高，具有统计学差异(P<0.05)；给药6个月的降糖三黄片低剂量组大鼠血清胰岛素偏高，停药1个月的降糖三黄片中、高剂量组大鼠胰岛素偏低，差异具有统计学差异(P<0.05)，但这些差异均无剂量依赖性，故无毒理学意义；其余观察期及其他组大鼠血清钾离子、氯离子、胰岛素含量无统计学差异(P>0.05)，结果见表2、表3。

3.2.5 降糖三黄片对大鼠肝肾功能指标的影响

与对照组相比，各组大鼠在给药3个月、6个月及停药1个月的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、尿素氮等肝肾功能指标无统计学意义(P>0.05)；给药6个月的降糖三黄片中、高剂量组大鼠血清肌酐偏低，具有统计学差异(P<0.05)，但并无生物学意义，结果见表4。

表2 降糖三黄片对大鼠血常规及凝血功能影响

表3 降糖三黄片对大鼠糖脂代谢、生化指标的影响

表4 降糖三黄片对大鼠肝肾功能的影响

3.2.6 降糖三黄片对重要脏器系数及组织形态学的影响

给药3个月、6个月及停药1个月，对各组大鼠脏器进行全面细致的肉眼尸检，未发现异常器官组织。各组大鼠的心脏、肾脏、肝脏、胰腺、卵巢、睾丸等13个脏器除个别动物出现动物自发性病变导致的组织形态学变化外，其余大鼠脏器未见异常组织形态学变化。与对照组相比，降糖三黄片低、中、高剂量组大鼠的脏器系数无统计学差异(P>0.05)，结果见表5。

表5 降糖三黄片对大鼠脏器系数的影响

4 讨论

降糖三黄片由本课题组基于中医治疗2型糖尿病的系列临床观察[1-2]，以中医经典《伤寒论》[6]记载的桃核承气汤为主方开发的制剂，由桃仁、桂枝、大黄、芒硝、黄芪、生地黄、麦冬、玄参、炙甘草组成。课题组前期一系列研究表明，该药物具有改善2型糖尿病糖脂代谢紊乱，延缓2型糖尿病心、肾并发症发生发展的作用[3-11]。为保证临床用药安全性，本研究按照《中药新药研究指南》[12]和《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》[13]的要求对降糖三黄片的毒性进行评价，以为新药研发提供安全性评价依据。

急性经口毒性试验结果显示，按照降糖三黄片最大允许浓度(0.6 g/mL)和最大允许剂量(20 mL/kg)给药后，动物未出现明显的毒性反应，表明降糖三黄片无急性毒性反应。长期给药毒性试验中，最大给药剂量9 g/kg(临床剂量的72倍)，连续给药6个月，大鼠的精神状态、行为活动、摄食量及排泄功能等一般生理状态均良好无异常，给药组个别大鼠大便偏软但并无腹泻，且停药后24 h能够恢复。与对照组比，降糖三黄片各剂量组大鼠体质量无明显差异，提示降糖三黄片对正常大鼠体质量增长无影响。给药30 d、60 d及停药后28 d的降糖三黄片各剂量组大鼠血常规、凝血指标、血糖、钠离子、胰岛素、肝肾功能指标、脏器系数与对照组相比无显著性差异；个别剂量组大鼠血清钾离子、氯离子、胰岛素含量与对照组有差异，但并无剂量依赖性及时间规律性，无毒理学意义。结合实验背景，极个别动物出现的脏器组织形态学变化为动物自发性病变，其余各组大鼠脏器均未见病理学损伤。因此，降糖三黄片对大鼠一般生理状态及肝脏、肾脏功能、生殖系统、腺体分泌、脏器组织学均无长期毒性及延迟毒性反应。

综上所述，降糖三黄片无急性毒性、长期毒性和延迟毒性反应，药物的最大耐受量(MTD)≥36 g/kg(临床剂量的288倍)；基本安全剂量(NOAEL)为9 g/kg(临床剂量的72倍)，在治疗剂量范围内用药安全性高。