载绞股蓝皂苷纳米结构脂质载体对DF大鼠创面愈合及ET-CGRP平衡的影响

李伟 刘涛 李霞 王巧云 白小岗 李哲玺

糖尿病会导致心血管疾病、肾病、视网膜病变、神经病变和下肢糖尿病性溃疡等并发症[1]。流行病学调查显示，糖尿病患者呈增长趋势。根据世卫组织的报告[2]，糖尿病影响全球4.22亿成年人，预计到2045年将达到6.93亿[3]，1/4的糖尿病患者会发展为糖尿病足(Diabetic foot，DF)。DF是糖尿病患者致死、致残的主要原因[4]。

伤口愈合过程需要细胞活化来激活，涉及表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESCs)、角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞，血小板和巨噬细胞等[5]。与健康人群相比，由于血糖水平升高，糖尿病患者创伤的愈合过程变慢。研究表明，糖尿病患者的ESCs没有接收到对于伤口定位至关重要的信号，导致创面血管生成的减缓，使创面愈合困难甚至迁延不愈[6]。

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)作为一种中草药，其药用价值主要在于可调节心脑血管、调血脂、降血糖、抗肿瘤、增强免疫力等[7]。绞股蓝的主要活性成分绞股蓝皂苷XLⅨ(Gypenosides XLⅨ)可促进组织的损伤修复和创面愈合。与其他皂苷类成分一样，XLⅨ的性质不稳定，可被肠内菌代谢成多种代谢产物，也能在胃液中被降解[8]，其生物利用度低。纳米结构脂质载体(Nanostructured lipid carriers，NLCs)不仅载药能力高而且生物稳定性好，缓释效果显著[9]。本文采用高压均质法制备载绞股蓝皂苷纳米结构脂质载体(XLⅨ-NLCs)，并评估XLⅨ-NLCs对ESCs细胞活性的影响，及其对DF创面愈合的修复、血浆内皮素(Endothelin，ET)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

100只清洁级成年SD雄性大鼠(延安大学实验动物中心)，7～8周龄，体质量230～286 g。ESCs(上海钦诚生物有限公司)；单硬脂酸甘油酯(国药集团药业股份有限公司)、Maisine35-1和LabrafilM1944 CS(佳法赛公司，法国)；大豆磷脂购自江苏海泰纳米材料有限公司；ET、CGRP的放免药盒(北京市福瑞生物工程公司)。

YP11-2型磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；Essentia LC-15C高效液相色谱仪(岛津公司，日本)；AX205十万分之一电子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；微纳颗粒激光粒径测定仪(济南微纳颗粒仪器股份有限公司)；透射电镜HD-2700购于日本日立高新技术有限公司。

1.2 XLⅨ-NLCs的制备

制备XLⅨ-NLCs：将XLⅨ加入到2 mL大豆磷脂中，得到100 μg/mL的XLⅨ，以10 mL去离子水溶解，构成水相，在74 ℃的水浴中持续磁力搅拌。将50 mg的Maisine35-1和20 mg的LabrafilM1944 CS溶解于3 mL体积的三乙胺以获得油相。将油相滴入到水相中。待体系澄清时，降低转速，继续搅拌至总体积的1/3，冰水浴2 h。最后经0.22 μm孔径滤膜滤过，得到XLⅨ-NLCs。

采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析XLⅨ-NLCs材料的纯度。用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)表征XLⅨ-NLCs颗粒的粒径和形状。广角X射线衍射(XRD)对XLⅨ-NLCs颗粒的晶体结构进行分析。用动态光学粒度分析仪测定XLⅨ-NLCs的粒径分布。

1.3 细胞培养

将ESCs培养于37 ℃、5%CO2培养箱中，DMEM培养基中含有10%BSA、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素，pH7.2～7.4。将ESCs细胞分为对照组、NLCs组、XLⅨ组、XLⅨ-NLCs组。对照组，为正常培养无处理的ESCs；NLCs组，正常培养的ESCs使用40 μg/mL NLCs处理12 h；XLⅨ组，正常培养的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ处理12 h；XLⅨ-NLCs组，正常培养的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ-NLCs处理12 h。

1.4 MTT法检测细胞活力

收集处于对数生长期的ESCs细胞，调整细胞浓度至5×104个/mL，接种于96孔板(100 μL/孔)，37 ℃下培养12 h。以MTT法检测细胞活力，在24、48和72 h时检测570 nm处的光密度值(OD)。细胞活性的百分比用作纳米脂质颗粒对细胞活力影响的评价指标。

1.5 DF创伤大鼠模型构建

2%的链脲佐菌素50 mg/Kg腹腔注射，72 h后尾静脉取血，测血糖值，血糖≥16.8 mmol/L提示DF大鼠制备成功。大鼠麻醉后在足背部剪开1 cm半径的圆形皮肤创口，暴露韧带，手术全程保持自然暴露。

1.6 动物分组与给药

将100只SD大鼠随机分为5组：正常组(n=20)、DF组(n=20)、DF+NLCs组(n=20)、DF+XLⅨ组(n=20)、DF+XLⅨ-NLCs组(n=20)。DF组、DF+NLCs组、DF+XLⅨ组、DF+XLⅨ-NLCs组均进行DF造模处理，正常组不制备DF模型，仅给予创伤处理。造模第2天给药，正常组和DF组不进行药物干预。DF+NLCs组、DF+XLⅨ组、DF+XLⅨ-NLCs组均进行灌胃给药，分别给予100 μL的NLCs、XLⅨ和XLⅨ-NLCs，每日1次，连续7 d。

1.7 指标检测

记录创伤后7 d的创伤面积，分析各组创伤愈合情况。第8 d，处死大鼠，沿窗口取边缘约1.0 cm×1.0 cm的皮肤组织，浸泡在40.0%甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，镜下观察。取材前获取大鼠静脉血3 mL，置于含10% EDTA 30 mL和400 IU抑肽酶的试管中，混匀，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-30 ℃冰冻保存。采用放射免疫法测定，并严格按照操作说明进行操作。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 XLⅨ-NLCs的物理性质和表征

采用高压均质法制备XLⅨ-NLCs，粒径参数通过DLS法测定。结果显示，XLⅨ-NLCs的直径为(207.92±21.75)nm(图1A)。包封率为73.61%±4.55%，载药量为5.23%±0.58%。透射电镜观察，XLⅨ-NLCs形状为近似球体，纳米颗粒分布均匀(图1B)。

A：动态光散射检测粒径大小；B：透射电子显微镜观察NLCs、XLⅨ-NLCs形态(标尺= 100 nm)。A: Dynamic light scattering measurement of particle size; B: Morphological observation of NLCs and XLⅨ-NLCs by TEM (scale=100 nm).图1 XLⅨ-NLCs的理化性质Fig.1 Physicochemical properties of XLⅨ-NLCs

2.2 XLIX-NLCs对ESCs的细胞毒性

观察对照组(Ctrl)、XLⅨ组、NLCs组、XLⅨ-NLCs组ESCs细胞的活性(图2)。与对照组相比，NLCs组与XLⅨ组中ESCs细胞活性均无显著差异(P>0.05)，而XLⅨ-NLCs组中ESCs细胞活性高于对照组、XLⅨ组和NLCs组(P<0.05)。

*： 与对照组比，P<0.05； #： 与XLⅨ组相比，P<0.05；&：与NLCs组相比，P<0.05。*: Compared with control group, P<0.05; #: Compared with XLⅨ group, P<0.05; &: compared with NLCs, P<0.05.图2 采用MTT法检测各组细胞毒性Fig.2 MTT assay was used to detect the cell cytotoxicity in each group

2.3 XLⅨ-NLCs对DF大鼠创面愈合的影响

如图3所示，伤后7 d时，DF组、DF+XLⅨ组、DF+NLCs组、DF+XLⅨ-NLCs各组的创伤面积均显著大于对照组(P<0.05)；DF+XLⅨ组、DF+NLCs组、DF+XLⅨ-NLCs组的创伤面积均显著小于DF组(P<0.05)；DF+XLⅨ-NLCs组的创伤面积均明显小于DF+XLⅨ组和DF+NLCs组(P<0.05)。

A：各组大鼠足部创伤愈合效果观察；B：各组大鼠足部创伤面积大小比较($： 与Ctrl组比，P<0.05；*：与DF组比，P<0.05；#： 与DF+XLⅨ组相比，P<0.05；&：与DF+NLCs组相比，P<0.05)；C：各组大鼠足部创伤部位组织HE染色。A: Observation of foot wound healing in each group; B: Comparison of foot trauma area of each group ($: Compared with Ctrl group, P<0.05; *: Compared with DF group, P<0.05; #: compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; &: Compared with DF+NLCs group, P<0.05); C: HE staining of the injured parts in each group.图3 XLIX-NLCs对DF大鼠创面愈合的影响Fig.3 Effects of XLIX-NLCS on wound healing of DF rats

光镜观察结果显示，DF组可见较多炎性细胞，少见成纤维细胞，罕见新生毛细血管；正常组的炎性细胞数量最少，成纤维细胞多，可见散在的新生毛细血管；与DF组相比，DF+NLCs组、DF+XLⅨ组可见少量的炎性细胞，成纤维细胞数量较多，大量新生毛细血管。DF+XLⅨ-NLCs组与DF+XLⅨ组、DF+NLCs组相比，炎性细胞量更少，成纤维细胞数量较多，新生毛细血管较多。总体而言，DF+XLⅨ-NLCs组毛细血管增生明显，成纤维细胞较多且染色较深，炎性细胞少见；DF+NLCs组和DF+XLIX组居中；DF组最差，极少见血管增生，炎性细胞浸润明显(图3C)。

2.4 XLIX-NLCs对DF大鼠ET-CGRP平衡的影响

图4显示，与Ctrl组比，DF组、DF+XLⅨ组、DF+NLCs组的ET水平均都显著上调(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs组变化不明显(P>0.05)。与Ctrl组比，DF组、DF+XLⅨ组、DF+NLCs组的CGRP水平均显著下调(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs组变化不明显(P>0.05)。DF+XLⅨ-NLCs组、DF+XLⅨ组、DF+NLCs组中的ET水平都显著低于DF组，而DF+XLⅨ-NLCs组、DF+XLⅨ组、DF+NLCs组中的CGRP水平都显著高于DF组(P<0.05)。DF+XLⅨ-NLCs组的ET水平显著低于DF+XLⅨ组和DF+NLCs组，DF+XLⅨ-NLCs组的CGRP水平显著高于DF+XLⅨ组和DF+NLCs组(P<0.05)。

A：血液中ET水平；B：血液中CGRP水平；$：与Ctrl组比，P<0.05；a：与DF组比，P<0.05；b：与DF+XLⅨ组相比，P<0.05；c：与DF+NLCs组相比，P<0.05。$: Compared with Ctrl group, P<0.05; a: Compared with DF group, P<0.05; b: Compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; c: Compared with DF+NLCs group, P<0.05.图4 各组大鼠血液ET-CGRP平衡的变化Fig.4 Changes of ET-CGRP balance of rat blood in each group

3 讨论

糖尿病患者皮肤损伤后极难愈合。研究表明，表皮干细胞分化和表皮细胞生长障碍、糖代谢紊乱、微血管病变、细胞生长因子受体及基质金属蛋白酶的表达异常等多种因素，均与糖尿病创面难愈有密切关系。Zhang等[5]的研究显示，ESCs可主动参与创面修复，并促进创面的再上皮化。ESCs在不同病期糖尿病大鼠皮肤中的分布规律，及其在糖尿病创面愈合过程中的动态变化，提示糖尿病创面表皮干细胞数量显著减少、活性明显降低，并存在局部特有的“干细胞库干涸”现象[10]。皂甙类药物具有多种药理活性，对创面愈合具有明显的改善作用[11]。XLⅨ是一种从中草药绞股蓝中提取出来的皂苷。研究发现，XLⅨ不仅可改善组织的损伤、调节机体炎症平衡，特别是对神经损伤[12]和心肌损伤有明显的改善作用[13]，且对肿瘤细胞的活性有抑制作用[14]。已有报道证实XLⅨ对糖尿病具有潜在的改善作用，例如改善糖尿病心肌病[15]和抗糖尿病[16]。然而，仍缺乏关于XLⅨ对糖尿病创伤修复的研究。本研究结果证实，XLⅨ修复DF大鼠创面效果明显优于未使用XLⅨ的对照组，而该愈合过程可能与促进表皮干细胞的生长有关。

DF的另一个关键影响因素是机体的末梢血管病。末梢血管病变可导致下肢感染趋于严重，形成溃疡并破坏深部组织。血管内皮损伤是DF血管病变的最初原因，血液中高水平的ET是血管内皮细胞损伤的关键标志之一；另外，CGRP是一种强的内源性血管舒张剂[17]。ET和CGRP的平衡是调节血管收缩与舒张功能关键，两者的合成、分泌及效应失衡可致血管紧张度改变，直接影响血流动力学的稳定性[18]。本研究发现，DF大鼠的ET水平明显升高、CGRP水平下降，符合已有的报道。本研究进一步发现，使用XLⅨ灌胃可明显抑制血液中ET的水平并提高CGRP的水平，表明XLⅨ可通过改善血管病变并增加DF创伤修复效率。

纳米材料对创伤愈合、抑制创口感染、组织再生等具有重要作用。固体脂质纳米颗粒(SLNs)具有受控输送系统的多种优势，代表了亲水和亲脂活性化合物的良好选择；没有生物毒性，可改善药物的生物利用度和靶向性；可通过生物屏障促进扩散；易制备获取，其生产过程可以是无溶剂的。多项研究提出，这种载体可改善伤口愈合。Arana等[19]将金盏菊提取物掺入SLNs中，以改善游离提取物的伤口愈合活性。NLCs是继固体脂质纳米粒(SLNs)之后的二代脂质体系，解决了SLNs存在的各种缺点。NLCs由液体脂质和固体脂质的混合物组成，具有更高的负载能力和更大的稳定性[20]。穿心莲内酯是一种天然的二萜内酯，具有抗炎和抗氧化作用，可改善伤口的愈合活性。然而，穿心莲内酯的问题与其水溶性低有关。Sanad等[21]将穿心莲内酯配制成脂质纳米载体，然后将其包含在壳聚糖-透明质酸复合海绵支架中，效果良好。本研究中，由于XLⅨ同样是一种低水溶性和低脂溶性药物，因此想要发挥其更高的效价，将XLⅨ负载于NLCs中，可能会在药物利用率上进一步提高。我们通过实验对比也证实了这一假设。我们构建了载绞股蓝皂苷的纳米脂质载体XLⅨ-NLCs并鉴定了其理化性质，观察到XLⅨ-NLCs对创伤修复的作用优于单独使用NLCs或XLⅨ，并且提高了 CGRP的水平并降低了ET水平。

综上所述，本研究探讨了NLCs-XLⅨ对DF创面修复的改善作用及其潜在的作用机理。尽管NLCs-XLⅨ对DF创面愈合活性的确切机制有待进一步研究，但本研究结果表明NLCs-XLⅨ具有有效的创面愈合活性。因此，NLCs-XLⅨ是一种可用于糖尿病足皮肤创面愈合的新的潜在药物。