石墨烯泡沫支架缓释netrin-1促进糖尿病大鼠创面愈合的研究

廉洁 秦金保 祝联

糖尿病患者创面难以愈合是临床常见且较为棘手的问题。若得不到及时有效的治疗，会出现进一步的创伤性感染、骨髓炎等[1]。糖尿病血管病变是其主要原因，发病机制复杂，包括高血糖导致糖基化终产物的形成、氧化应激反应等。

研究表明，再生支架是促进皮肤损伤修复的可行方法。明胶-甲基丙烯胺(GelMA)结合了天然和合成水凝胶的特点，已被证实是一种很有前途的三维组织构建支架材料[2]。然而，由于GelMA的生物力学性能和抗菌性能较差，其在创面修复领域的应用受到限制。石墨烯具有优异的力学性能、热学性能、导电性和生物相容性，以石墨烯为基质的支架可以调节多种细胞的生长、相互作用和细胞迁移，如人胚胎干细胞和间充质干细胞等[3]。我们的前期研究发现，石墨烯泡沫能够促进神经细胞的迁移、增殖和分化[4]。研究表明，石墨烯在体内通过中性粒细胞髓过氧化物酶溶解，经肾脏排泄清除，具有良好的生物降解性[5]。

血管再生是糖尿病创面修复的关键。神经轴突导向生长因子-1(netrin-1)被认为是一种有前途的促血管再生的细胞因子。研究显示，netrin-1 通过下游分子通路增加NO的生成，减少氧自由基的产生，防止内皮功能受损，并能够促进血管内皮祖细胞的迁移，促进血管生成[6]。

我们之前利用化学气相沉积(CVD)法制备石墨烯泡沫支架并填充水凝胶GelMA，利用藻酸盐对水凝胶进行渗透，并通过双网络结构改善凝胶的力学性能，同时负载netrin-1，使其渗透到杂化水凝胶中达到缓释目的[4]。本研究中，我们对搭载netrin-1的石墨烯泡沫水凝胶支架在糖尿病大鼠创面中的疗效进行研究，具体报道如下。

1 材料与方法

实验动物：30只6～8周龄GK大鼠，体质量约200 g，雌雄不限；10只雄性BALB/c裸鼠，6周龄(南京君科生物工程有限公司)。

实验材料：人脐静脉内皮细胞系，内皮细胞完全培养基(上海中乔新舟生物科技有限公司)；兔抗细胞角蛋白(CK19)多克隆抗体(Santa Cruz，美国)；磷酸缓冲液，Matrigel凝胶，Gelatin(Sigma，美国)；镍网(常州康威医疗器械有限公司)；CCK8试剂(Abcam，英国)。

1.2 人脐静脉内皮细胞系(hUVECs)的复苏和传代

快速在37 ℃水浴槽中解冻hUVEC细胞，转移至生物安全柜。在15 mL离心管中添加9 mL内皮细胞培养基，逐滴加入hUVEC细胞，轻柔混匀，1 500 r/min离心5 min。弃上清，用培养基重悬细胞后，接种至培养瓶中，在37 ℃、5%CO2和95%湿度条件下培养细胞，次日更换培养基。当细胞融合至80%左右时，进行传代。

1.3 皮肤支架的制备及生物相容性检测

制备方法参考文献[4]。首先合成石墨烯/镍网片，接着合成GelMA和杂化水凝胶前体溶液，最后通过紫外照射和离子化促进水凝胶支架的快速固化。4 ℃时，将合成的石墨烯泡沫水凝胶皮肤支架置于含100 ng/mL netrin-1的PBS溶液中15 min，使水凝胶成分充分吸收netrin-1，形成具有缓释功能的netrin-1+石墨烯泡沫水凝胶皮肤支架。

雄性BALB/c裸鼠10只，随机分为2组，实验组将直径1 cm的支架植入裸鼠背部，对照组小鼠注射相同体积的PBS溶液。术后2周切取支架及周围皮肤进行组织学检测观察损伤及炎症情况(图1)。

图1 石墨烯泡沫水凝胶支架大体观察(左，标尺=500 μm)和裸鼠皮下植入术(右，标尺=500 μm)Fig.1 Gross observation of graphene foam gel scaffold (Left, scale bar=500 μm) and subcutaneous implantation of scaffold in nude mice (Right, scale bar=500 μm)

1.4 支架材料的细胞毒性检测

将石墨烯泡沫水凝胶支架和荷载netrin-1的石墨烯泡沫水凝胶支架分别剪成直径≤5 mm的片状颗粒，4 ℃浸泡于DMEM溶液24 h，分别收集提取两种浸出液，以DMEM为对照组，分别与100 μL的hUVECs共孵育于96孔板中。24 h、48 h和72 h后采用CCK-8试剂盒检测各组细胞光密度值。

1.5 大鼠皮肤缺损修复实验

选用30只GK大鼠，建立糖尿病大鼠皮肤缺损模型后分为3组：空白对照组(n=10)、支架组(n=10)和支架+netrin-1组(n=10)。支架+netrin-1组：大鼠背部手术，形成直径10 mm全层皮肤缺损，将负载netrin-1的支架材料移植覆盖于创面，材料上覆盖硅胶膜，并缝合固定于创面周围皮肤，避免移位；支架组：将单独的支架材料移植覆盖于创面；空白对照组：不给予创面特殊处理。术后第3、7、14天观察各组动物的创面愈合情况。术后第7、14天每组分别取材5只大鼠，HE染色观察组织学变化，Masson染色观察胶原合成情况，CK19免疫组化染色观察上皮细胞生成情况。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 石墨烯水凝胶皮肤支架具有良好的生物相容性和低生物毒性

HE染色显示支架材料周围组织在细胞密度、支架降解以及胶原形成和排列方面与对照组无明显差异。植入支架的小鼠皮肤未见明显的组织损伤和炎症改变，说明该支架具有良好的生物相容性。CCK-8实验发现，24 h时3组细胞增殖无明显差异；48 h时支架组和支架+netrin-1组的细胞增殖明显优于对照组(P<0.05)，且这2组间未见明显差异；72 h时支架+netrin-1组细胞增殖明显优于其他两组(P<0.05)，而支架组和对照组之间无明显差异。说明支架具有较低的生物毒性(图2、3)。

A：对照组；B：实验组A: Control group; B: Experimental group图2 支架材料植入裸鼠皮肤2周后HE染色(标尺=200 μm)Fig.2 HE staining was performed 2 weeks after the scaffold was implanted into the skin of nude mice (scale bar=200 μm)

图3 石墨烯泡沫水凝胶支架材料的生物毒性检测(**： P<0.01)Fig.3 Toxicity test of graphene foam hydrogel scaffold (**: P<0.01)

2.2 Netirn-1/石墨烯水凝胶支架通过增加血管生成，促进细胞外基质沉积，促进创面的愈合

术后第3天时，各组之间创面大小无明显差异，表面覆盖分泌物，其中支架+netrin-1组的创面较其他组基底更红润，表面分泌物较少。术后第7天时，所有创面均已结痂，支架组和支架+netrin-1组出现部分上皮化，其中支架+netrin-1组上皮化程度明显优于支架组。术后第14天时，支架组和支架+netrin-1组的水凝胶脱落，支架+netrin-1组创面面积最小，皮肤缝隙关闭较其他组更好，空白对照组仍残余部分痂皮未脱落(图4)。

图4 各组创面第3、7、14天时的大体观察(标尺=50 μm)Fig.4 Gross observation of wound in each group 3, 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

HE染色显示，术后第3、7天时，支架+netrin-1组的上皮化程度和真皮再生的厚度均明显优于其他组，炎症反应和瘢痕残留均较其他组减轻(图5)。

图5 各组创面第7、14天时的H&E染色(标尺=50 μm)Fig.5 HE staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

Masson染色显示，术后第7、14天时，支架+netrin-1组的真皮胶原沉积量明显大于另外2组，提示netrin-1可能促进成纤维细胞的胶原合成和增加了细胞外基质沉积(图6)。

图6 各组创面第7、14天时的Masson染色(标尺=200 μm)Fig.6 Masson staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

CK19指细胞角蛋白19片段，是上皮细胞的特征性蛋白组分，在多种正常上皮组织中存在。为了进一步验证创面上皮化的程度，我们进行了CK19的免疫组织化学染色。结果显示，支架+netrin-1组表皮厚度明显大于其他2组，支架组的上皮厚度明显大于对照组，提示石墨烯泡沫水凝胶支架或者netrin-1可能促进角质细胞的迁移和增殖，有利于创面愈合(图7)。

图7 各组创面第7、14天时CK19免疫组化染色(标尺=200 μm)Fig.7 CK19 immunohistochemical staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

3 讨论

目前已报道的用于糖尿病创面皮肤修复的支架材料，包括天然和人工合成支架，存在黏附性差、韧性不足及生物相容性不高等缺点，在临床中通常不被推荐使用[7]。石墨烯的优异机械性能使其在蚀刻镍后仍能保持其形状，起到增强支架形态作用。石墨烯支架的韧性与皮肤相似，弥补了单纯水凝胶支架力学性能较差的缺点，并且石墨烯水凝胶支架的缓释特性适宜搭载促进愈合的生物因子应用于创面修复。有研究将氧化石墨烯与经过改性的胶原-壳聚糖复合膜结合制备复合生物膜，其上负载碱性FGF，用于修复创面。这种新型药物传送系统，可避免药物在体外和体内应用时出现突释，过早丧失生物活性，可明显促进皮肤缺损修复[8]。

近年来，干细胞和血管营养因子被用于提高皮肤再生的效率。netrin-1是一种神经轴突导向生长因子，其结构高度保守，目前已知的家庭成员有netrin-1～4，其受体主要有结肠癌缺失蛋白(DCC)和不协调蛋白5(UNC5)。在糖尿病相关研究中，netrin-1的功能比较突出，可通过DCC-ERK1/2通路增加NO的生成，减少氧自由基的产生，增强内皮细胞的功能；另外，由于内皮细胞成管与VEGF相关信号通路密切相关，不同浓度的netrin-1 可以激活或抑制VEGF信号通路。我们的前期研究发现，netrin-1的作用具有浓度依赖性，在100 ng/mL的缓释浓度下，netrin-1可明显促进内皮细胞成管和RSC96神经细胞的迁移[4]。

本研究以石墨烯水凝胶支架负载netrin-1修复糖尿病创面，石墨烯泡沫支架具有抗炎作用，水凝胶可以缓释netrin-1促进血管形成，这两者都是糖尿病创面修复的重要因素。研究结果显示，石墨烯的生物相容性高且细胞毒性较低；进一步的动物实验结果显示，netirn-1/石墨烯泡沫水凝胶支架治疗后，创面组织中血管密度和细胞外基质增加，上皮化程度高。因此，netirn-1/石墨烯水凝胶支架可通过血管再生和细胞外基质沉积，促进糖尿病创面的愈合。