PCOS患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4表达及其临床意义研究

杨晓艳，刘爱敏

（安阳市妇幼保健院妇产科，河南 安阳 455000）

多囊卵巢综合征（PCOS）是女性常见的内分泌紊乱性疾病，发病率约为10%[1]，常以月经不调、肥胖、不孕、闭经及合并多系统代谢紊乱为主要临床症状[2]，有研究报道[3]高雄激素血症、胰岛素抵抗（IR）是PCOS 发病的中心环节。葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）是在胰岛素刺激下负责外周组织摄取葡萄糖在葡萄糖转运障碍介导的胰岛素抵抗过程中起重要作用[4]。有研究报道[5]PCOS 病历生理性改变主要表现为卵泡发育和闭锁失衡，调节该动态过程的重要基因包括B细胞淋巴瘤-2（bcl-2）/Bax，Bax/Bax 异源二聚体增多使bcl-活性降低则可加速细胞凋亡，引起卵泡闭锁等[6]。本研究选取2017年1 月至2019年6 月在我院治疗的PCOS患者72例，其中合并胰岛素抵抗患者40例（HOMAIR≥2.8），同时选取其他因素不孕患者50例作为对照组，对比分析两组患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白及mRNA的水平差异，旨在确定Bcl-2、GLUT4对PCOS 诊断及是否合并IR 鉴别提供科学依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1 月-2019年6 月在我院治疗的PCOS患者72例，其中合并胰岛素抵抗患者40例（HOMA-IR≥2.8），纳入标准：⑴PCOS诊断符合《妇产科学》中的标准；⑵无心、肝、肾、肺等重要脏器疾病；⑶患者知情同意。排除标准：⑴入组前3 个月有激素类药物使用史；⑵有吸毒、药物滥用史等不良嗜好者。同时选取月经周期规律，因输卵管狭窄等其他因素不孕患者50例作为对照组，PCOS 组和对照组年龄等一般资料比较无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 PCOS 组和对照组一般资料比较

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化染色 将子宫内膜组织处理后制成石蜡包埋标本，并用4%多聚甲醛溶液固定3 d 以上，调整切片厚4μm，连续切片。5%多聚赖氨酸处理载玻片同时进行染色，直到出现棕黄色为止，显微镜下观察照相。根据免疫显色强度和阳性细胞密度进行标准分级。光学显微镜400 倍视野下计数各组中的总细胞及阳性细胞数，表达Bcl-2/GLUT4的细胞呈棕色，计算每组的平均阳性细胞率并照相。

1.2.2 RT-PCR 检测 主要试剂、耗材：无水乙醇、氯仿、异丙醇购于广州市化学试剂厂；裂解液缓冲液、PrimeScri p t TM RT Master Mix、PrimeScri p t TM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq TM

Trizol 法抽提与纯化总RNA：trizol 法提取血清及组织总的RNA，并置于-80℃保存。

RNA 纯度和浓度检测：取1μl 总RNA 溶液,利用核酸蛋白定量仪测定吸光度值OD260/OD280比值和RNA 浓度,若比值范围在1.8～2.0,表明纯度符合要求。逆转录反应：以总RNA 为模板，按照大连宝生物TaKaRa 公司的RNA 逆转录试剂盒说明书操作，采用一次性20μl 标准逆转录反应体系。逆转录反应:以总RNA 为模板，按照大连宝生物TaKaRa 公司的RNA 逆转录试剂盒说明书操作，采用一次性20μl 标准逆转录反应体系。

1.3 统计学处理 数据统计分析采用SPSS22.0 软件，Bcl-2、GLUT4 等计量资料采用平均数±标准差表示，组间差异比较使用独立样本t 检验，相关性采用Pearson 分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCOS 组和对照组子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较 PCOS 组子宫内膜膜Bcl-2、GLUT4蛋白和mRNA表达明显低于对照组（P＜0.05），见表2和图1。

表2 PCOS 组和对照组子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较

图1 子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白免疫组化染色图

2.2 PCOS 组有无胰岛素抵抗患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较 PCOS 组合并胰岛素抵抗患者子宫内膜膜Bcl-2、GLUT4蛋白和mRNA表达明显高于无胰岛素抵抗患者（P＜0.05），见表3。

表3 PCOS 组有无胰岛素抵抗患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较

2.3 PCOS 组不同年龄、体质量指数患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较 PCOS 组不同年龄、体质量指数患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较差异无统计学意义(P＞0.05),见表4。

表4 PCOS 组不同年龄、体质量指数患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达比较

2.4 相关性分析 将PCOS 组子宫内膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表达进行相关分析,结果显示：Bcl-2、与GLUT4蛋白呈正相关（r=0.300，P＜0.05）；Bcl-2和GLUT4 mRNA 呈正相关(r=0.317,P＜0.05)。

3 讨论

PCOS 是临床上常见的妇科内分泌系统疾病，临床症状大多表现为慢性无排卵、月经失调、多毛、痤疮等，但临床表现同时存在较强的异质性。超声和组织学检查可见双侧卵巢呈多囊性改变，病理改变可涉及神经、内分泌、代谢等多系统，范围广泛，可同时引起多系统的功能紊乱及卵巢局部调控失常[7,8]。寻找理想的病理研究模型以深入研究多囊卵巢综合征发生发展机制，为其临床治疗提供新的思路是学者亟待解决的问题。目前关于高胰岛素血症和胰岛素抵抗（IR）与PCOS 发生发展关系的研究是热点和重点。子宫内膜葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）是葡萄糖转运蛋白家族成员中负责子宫内膜细胞基础糖需求的一员，受IR的影响[9]。有研究通过给予患者排卵药物治疗后尽管获得较高排卵率但妊娠成功率依旧很低，可能与PCOS患者子宫内膜缺陷有关[10]。本研究探讨子宫内膜GLUT4水平与PCOS 相关性，以评估子宫内膜生理状态与PCOS 发生发展的相关性。研究结果显示，合并胰岛素抵抗的PCOS患者组子宫内膜GLUT4 弱表达。与既往研究报道一致[11,12]。可能与子宫内膜细胞分化和代谢异常有关。本研究还发现，合并胰岛素抵抗的PCOS患者较未合并IR的PCOS患者子宫内膜处的GLUT4水平显著降低。说明，胰岛素抵抗参与子宫内膜代谢异常过程，引起子宫内膜功能性障碍，可解释临床上PCOS患者的着床失败和低妊娠率。胰岛素与其受体结合后诱导自身磷酸化，促进细胞内转运葡萄糖的GLUT4 转移至细胞膜上，促进葡萄糖的跨膜转运，为子宫内膜生物学功能的发挥提供能量[13]。当胰岛素与其受体结合异常，自身丝氨酸磷酸化水平受抑制，使络氨酸激酶诱导葡萄糖跨膜转运的活性降低，子宫内膜代谢所需能量不足，限制子宫内膜生物学功能的发挥，子宫内膜缺陷，最终导致着床失败和低妊娠率，诱导PCOS的发生发展。

子宫内膜细胞凋亡和增生的失调可能与子宫内膜生理状态关系密切,一旦子宫内膜细胞增殖和凋亡动态平衡被打破，子宫内膜的生长状态会受影响，最终有可能抑制其生物学功能的发挥诱导PCOS的发生和发展。Bcl-2 是具有蛋白质结构特点的细胞凋亡直接抑制因子，与促进细胞凋亡的Bax 直接可相互作用形成Bax/Bax、Bcl-2/Bcl-2 同源二聚体或Bax/Bcl-2 异源二聚体。若Bax/Bax 同源二聚体增多则会降低Bcl-2的活性，加入细胞凋亡。相反，若Bxl-2蛋白含量增加，Bcl-2/Bax 异源二聚体含量增多，使Bax/Bax 同源二聚体更加稳定，最终表现为Bcl-2 活性，抑制细胞凋亡[14,15]。有研究报道[16,17]Bcl-2在卵巢GCT 中表达显著低于正常组织，提示Bcl-2在卵巢GCT的发生发展机制中起着重要作用，同时由于Bcl-2 是线粒体凋亡通路中重要因子。故说明Bcl-2通过调节线粒体凋亡途径，成为卵巢GCT 发生发展分子机制过程中的重要因素，有望成为卵巢GCT 生物学行为的标志。本研究结果显示，PCOS患者较其它原因的不孕患者子宫内膜膜Bcl-2水平显著降低，且合并IR的PCOS患者较未合并IR的PCOS患者子宫内膜膜Bcl-2水平显著降低。与既往研究报道一致[18,19]。说明，Bcl-2 异常介导细胞凋亡通路异常，是PCOS 形成的重要分子机制，Bcl-2 可作为子宫内膜凋亡状态的反映指标。本研究结果显示，Bcl-2与GLUT4表达间呈正相关，联合两指标水平变化的评估对PCOS 诊断具有重要意义。

综上所述，PCOS患者子宫内膜Bcl-2、GLUT4表达下调，可能与患者胰岛素抵抗有一定关系，两者间表达有正相关关系。