ICU 病房环境微生物分布特征

毛璞，颜乐平，单靖岚，王亚，张容，叶丹

（1.广州医科大学附属第一医院医院感染管理科，广东 广州 510120；2.广州医科大学附属第一医院重症医学科，广东 广州510120）

ICU 病房患者病情重，侵入性操作多，是院内感染控制的重点部门。医疗环境是院内感染交叉传播和流行的主要源头及介质。本研究对医院ICU病房环境及医护人员进行微生物分布的随访监测，研究其分布特征，为ICU 病房感染的预测提供理论依据，指导医院感染防控措施。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2019年3 月，对重症监护室的病房环境进行采样，样本来源包括医护人员手部、医护人员鼻部、回风口、物体表面（笔、病历夹、电脑、屏幕、按钮、键盘、床栏、治疗车）、医护人员工作服等。

1.2 采样及检测方法 根据WS/T367-2012 《医疗机构消毒技术规范》中的相关方法进行采样。将采集的棉试子放入洗脱液中充分振荡后，加入肉汤培养基中进行增菌，37℃培养24h,接种在普通营养琼脂培养基中。挑取单菌落于血琼脂平板上扩大培养24h，用于脂肪酸的提取。

1.3 微生物鉴定 利用脂肪酸气相色谱分析方法进行微生物鉴定。首先，菌体脂肪酸甲酯的提取⑴皂化：取适量（35～40mg）培养物于8ml 螺口玻璃管中，加入lml 皂化试剂（45g NaOH,150ml 甲醇,150ml ddH2O），拧紧螺盖，100℃沸水浴5min，取出振荡5～10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min。⑵甲基化：将样品管冷至室温后，加入2ml 甲基化试剂（325ml 6N 浓盐酸，275ml 甲醇），拧紧螺盖振荡，于80±1℃水浴l0min，水浴冷却。此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏。⑶萃取：在冷却的样品管中加入1.5ml 萃取溶剂（200ml 己烷，200ml 甲基叔丁醚）混匀，快速振荡l0min，弃去下层水相。⑷洗涤：在剩余有机相中加人3ml 溶液Ⅳ，快速振荡5min 左右，取2／3上层有机相置气相色谱样品瓶中，拧紧瓶盖备用上机。采用Agilent 7890A 气相色谱仪进行脂肪酸甲酯分析。MIDI Sherlock 系统根据各脂肪酸组分保留时间计算等链长值,确定目标组分的存在,采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(SI)，从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。在鉴定结果的判断上，一般SI≥0.5 (肠杆菌科细菌需达0.7 以上)，且第一选择和第二选择的SI 差值大于0.100，则可以认为鉴定成功。若SI 值在0.3-0.5 之间，且第一选择和第二选择的SI 差值大于0.100，则表明第一选择与第二选择分开，鉴定可能成功，但第一选择所列的菌种为非典型菌株。当SI值小于0.300 时，则认为该菌株不存在于数据库中。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当报告的几个菌种的SI 比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。

2 结果

2.1 微生物检出情况 共采标本229 个，分离51个菌株，阳性率为22.27%（51/229）。见表1。

表1 ICU 病房微生物检出情况

2.2 菌种分布情况 气相色谱成功鉴定51 株，分离G＋球菌25 株，以微球菌为主（20/25）；G＋杆菌9株；G-杆菌17 株，肺炎克雷伯氏菌（6/12）和粘质沙雷菌（5/12）占主要部分。

3 讨论

重症监护室病房的患者由于免疫力低下、接受侵入性操作多，易出现细菌感染性疾病[1]。院内感染最常见的致病菌，包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和粘质沙雷氏菌[2]。本次ICU 病房分离的常见病原菌中，肺炎克雷伯菌的检出率最高（6/51），该菌对人致病性较强，易产生耐药性[3]，是重要的条件致病菌。曾在美国引起院内感染，并扩散到不同地区[3]。本研究结果提醒谨防该菌在ICU 病房的流行。

研究发现医护人员鼻部和回风口培养的阳性率最高。鼻腔是人体呼吸系统的首个门户，对吸入的空气起过滤作用。我院的结果显示常见病原菌中以铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌定植于医务人员的鼻腔。而以往研究报道金黄色葡萄球菌较多定植于鼻腔[4]。这可能与在西方国家金黄色葡萄球菌的流行及受重视程度高有关。

表2 ICU 病房菌种分布情况

空气经新风口送入病房，然后经回风口回流。回风口处截流部分病房空气中的菌株，此处分离的菌株可以代表病房空气中的菌株。微球菌在自然空气中细菌分布比例最高，其中藤黄微球菌最为常见。本研究发现回风口处分离的G＋球菌以微球菌为主要，其中又以藤黄微球菌所占比较最高。此处分离的G-杆菌以肺炎克雷伯菌为主，且分离的菌种组成与医护人员鼻腔分离的菌种组成相近，均以肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌和铜绿假单胞菌等常见院内感染病原菌组成。鉴于回风口属于ICU通风换气系统，通风口的环境易于病原微生物生长繁殖，同时易导致微生物的扩散，加之近年来微球菌引起的临床感染时有报道[5,6]，提示须加强回风口的清洁管理。同时医务人员的手、物体表面、工作服等样本的阳性率较低，表明手卫生、病房内高频率接触的物体表面和仪器设备的日常清洁执行效果好。

现行常用的微生物鉴定方法主要为微生物生化鉴定。本研究采用的是气相色谱法，利用Sherlock 全自动细菌鉴定系统对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对鉴定微生物[7]。气相色谱在分析大量样品时具有全自动、速度快、精度高、费用低的优点[8]。细菌在第一步皂化过程即被杀灭，整个试验过程安全可靠。尽管该技术已应用于同源性分析，如霍乱弧菌[9]，食品工业的污染菌沙门菌[10]等，但在常见病原菌的同源性分析上，与传统脉冲场电泳分析结果的一致性较差[11,12]，因此在本研究中没有进行同源性的分析。