免提取冻干式百日咳鲍特菌核酸检测方法建立及应用

郭鹏波，章波，王彦红，高利飞

（1.郑州儿童医院 儿科医学研究所，河南 郑州 450000；2.安图生物，河南 郑州 450000）

百日咳是由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)侵入人体呼吸道而引起的急性呼吸道传染病[1]。主要特征是阵发性痉挛性咳嗽，且咳嗽时间为2～3个月，故名"百日咳"[2]。百日咳是由革兰阴性杆菌引起的高度传染性呼吸道疾病[3]。尽管疫苗覆盖率很高，但近日百咳仍在复苏[4]，且对人类健康产生巨大威胁[5]。由于百日咳鲍特菌毒性区和致病因子比较复杂，在最近的10～20年内，全球百日咳患病人数有明显的上升趋势[6]，且在我国陕西、天津和新疆等地百日咳患者也有增加的趋势[7-9]。由于中国的百日咳发病率呈现逐年递增的趋势，如何在发病早期快速诊断和检验出百日咳鲍特菌，已经成为当前的热点。目前已经报道的有细菌培养、酶联免疫检测法、核酸检测法等多种方法，核酸检测法虽然敏感度最高[10]，但操作技术要求高，限制了本方法的临床应用。本文对百日咳的荧光定量实验室诊断方法进行改进优化，建立了快速的便携式百日咳鲍特菌核酸检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 临床样本来自郑州儿童医院，百日咳鲍特菌DNA 来源于河南CDC，细菌基因组DNA提取试剂盒购于凯杰生物公司，PCR 产物纯化及质粒DNA 抽提试剂盒购自TaKaRa 公司，2×Taq PCR MasterMix(KT201)购自北京天根生化技术有限公司,引物合成和测序由上海生工生物有限公司、抗干扰Taq 酶购自百奥莱博。主要仪器有Thermo Nano-Drop 2000c 超微量紫外分光光度计、Biometra TT100PCR 仪、博医康Pilot5-8S 冷冻干燥机及安捷伦荧光定量PCR 仪。

1.2 质粒标准品的制备 以百日咳鲍特菌DNA 为模板，以IS481 上下游为引物(IS481F1:5'-CTAGGTGTGAAGATTCAATAG-3'；IS481R1:5'-TAGCTGTGAAGATTCAA-3') 进行PCR 反应。应总体系20μl,含1μl 提取产 物、上下游 引物各0.5μl(10mM)、10μl 2×Taq PCR MasterMix和ddH2O(补足到20μl)。PCR 反应程序为：预变性95℃5min，变性94℃30sec、退火55℃30sec、延伸72℃1min，30个循环，之后延伸72℃l0min。用1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析片段。将PCR 产物用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0 进行切胶回收纯化后，连接到PUC57 载体上，热激转化到大肠杆菌DH5α，进行氨苄(Ampicillin) 抗性筛选。选取含阳性质粒的菌液送擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在NCBI 上进行比对，结果显示序列一致。抽提质粒，经超微量紫外分光光度计准确定量后计算拷贝数，梯度稀释之后可以作为QPCR的定量模板标准品。

1.3 引物及探针的设计 参考GenBank 中百日咳鲍特菌IS481基因序列(登录号BX470248)，采用Primer 5.0 软件，设计出了一组引物探针用检测百日咳鲍特菌，扩增长度为156bp（IS481F:5'-ACCGCTTTACCCGACCTTACCG -3';IS481R:5' -GATGCCAGTTGTAGTGGTGTAGCC-3';P:5'-CATCCA GTCGGCCTTGCGTGAGTGG-3'），探针5’端FAM报告基因，3’端标记BHQ1 淬灭集团。引物探针特异在NCBI 上进行BLAST 验证，均由上海生工生物公司合成并纯化。

1.4 检测体系的建立及冻干处理 拭子样本的洗脱，采用病毒采样液洗脱拭子样本。洗脱液充当了后续冻干体系的复溶液。

本检测体系采用抗干扰Taq 酶和抗干扰PCR反应缓冲体系，实现咽拭子洗脱物直接扩增检测。同时采用冻干式PCR 试剂，即添加冻干保护剂，将PCR 体系冻干，实现PCR 试剂体系的一管式常温稳定存储，只需添加样本即可直接在Q-PCR 仪器上反应检测，降低操作复杂度，实现核酸检测的便捷化操作。

冻干用Q-PCR 液体试剂的配制（PCR 反应总体系20μl）：上下游引物各1.2μl(10mM)、0.6μl的TaqMan Probe (10mM)、2μl 抗干扰Taq 酶（5U/μl）、10μl 2×抗干扰qPCR buffer、5ul 4×冻干保护剂。

Q-PCR 试剂冻干：Q-PCR 试剂在超低温冰箱冷冻Q-PCR 液体试剂12h,将冻干机预冻2h、再将预冻好的试剂放入冻干机,在冻干机内一次升华干燥-30 摄氏度10h、二次升华干燥45℃5h、三次升华干燥40℃8h。用铝塑膜将冻干好的试剂真空塑封，常温储存。

PCR 反应程序为：95℃预变性5min 后，95℃变性10sec、60℃延伸30sec（采集荧光），40 个循环。反应结束后分析荧光值。

1.5 检测体系灵敏度评价 利用所建立的Q-PCR反应体系，以灭菌双蒸水为阴性质控品，以百日咳鲍特菌NCTC58209 标准菌株DNA 样品做为阳性质控品。检测用TE 连续10 倍稀释至浓度在1.0×101～1.0×107copies/mL 间的质粒DNA 样品，来验证实验体系的灵敏度，Q-PCR 扩增检测，以Ct 值为纵坐标，浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，计算相关系数，确定检测灵敏度。

1.6 检测体系特异性评价 采用阴性标本、肺炎链球菌、结核分枝杆菌检测，评价检测体系特异性。

1.7 检测体系重复性评价 选择不同稀释度的3个标本进行定量PCR 检测,每个样本重复10 次,通过计算同一样本Ct 值的差异来验证方法的重复性。

1.8 临床样本应用评价 收集2018年6 月-2019年2 月郑州儿童医院收治的上呼吸道感染患者，咽拭子样本227例，采用建立的Q-PCR 体系对所收集的上呼吸道感染者的咽拭子标本进行检侧。检测阳性样本的扩增产物，用基因测序进行确认。

2 结果

2.1 灵敏度 评价结果我们对1.0×107～1.0×101copies/ml的IS481 质粒标准品进行Q-PCR 检测分析,结果10copies/ml 样品未检出，1.0×107copies/ml～1.0×102copies/ml 样品检出；选择有阳性检出的1.0×107copies/mL～1.0×102copies/ml 反应点，以质粒拷贝数的对数为X 轴，以检测Ct 值为Y 轴制作标准曲线,我们获得标准曲线Y=-3.4857X+39.2，即斜率为-3.4857，相关系数为0.9936（图1），相关系数符合要求，我们确定本检测体系检出限约为100copies/ml。

图1 实时荧光定量的标准曲线

2.2 特异性评价结果 阴性标本、肺炎链球菌、结核分枝杆菌检测无特异性扩增曲线，结果均呈阴性。

图2 荧光定量PCR 灵敏度试验(A～G1.0×107～1.0×101copies/ml)

2.3 重复性评价结果 3 个标本重复性检测结果见表1 。CV在合理范围内（＜2%），说明构建的检测体系具有良好的可重复性。

表1 荧光定量PCR 方法检测百日咳的重复性实验结果

2.4 临床样本检测通过所建立的实时荧光定量PCR 技术，对所收集得到的227例急性上呼吸道感染者的咽拭子标本进行检测，结果显示，荧光定量PCR 检测出9 份阳性，其阳性率为3.96%。检测结果见表2。9例阳性样本的PCR 产物，经基因测序鉴定为百日咳基因序列，说明反应体系检测准确。

表2 9 份阳性样本检测Ct 值

3 讨论

最近几年，百日咳感染和传播患者的发病率出现升高的情况，且在接种疫苗的区域患者人数也呈现逐年增加的趋势。张德著等[11]对贵州省百日咳频发地区的605 份健康人血清抗体水平进行检测，发现健康人群血清中百日咳鲍特菌总IgG水平较低。因此，尽管存在接受疫苗免疫的人群，但仍然可能有感染百日咳的风险。由于患病风险的增加，且百日咳的诊断标准不统一，实验室还未有完整的百日咳相关早期诊断标准，根据上述原因和影响可能会导致百日咳早期患者诊断受到延误，增大了患者的病痛和传染源风险[12,13]。

百日咳菌的样本采集按照美国疾病预防与控制中心(CDC)推荐的鼻咽拭子标本方法[14]。采用培养鉴别的方法因为时间周期比较长对临床早期诊断价值不大。通过酶联反应来检测相应的抗体存在，可以用来检验百日咳，但检测样本需要比较急性期和恢复期成对的血清标本,不利于早期诊断[15]。Q-PCR 荧光探针检测方法具有灵敏度高和特异性强的特点[16],但操作要求高,需要在专业的PCR实验室检测，检测流程涉及核酸提取，PCR 体系构建，PCR 扩增检测等系列专业技术环节，不便于临床广泛推广应用。本研究建立了一种简便式百日咳核酸检测方法，不需要核酸提取，不需要PCR 体系构建，采用样本直接扩增，冻干式全组分PCR 体系，实现了拭子洗脱物直接加样PCR 检测，极大简化了操作步骤，降低了操作技术要求，本技术具有POCT 核酸检测的可能性，为百日咳鲍特菌的分子诊断新途径奠定基础。

通过采用本研究建立的百日咳检测体系对郑州地区的百日咳样本进行筛查，结果显示：发现郑州地区呼吸道感染住院儿童百日咳阳性率为3.96%左右，百日咳病情有增加 的趋势。提示应尽快开发并完善百日咳检测方法，使百日咳患者能够尽快确诊，以便协助临床医生诊治百日咳。