NEFA 对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡因子基因表达的影响

付世新，邢菲菲，罗胜缤，曹一鸣，温小庆，李美娟，罗春海

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

胎衣不下（Retained fetal membranes，RFM）是奶牛临床常见的繁殖障碍疾病之一，大多数研究将牛的胎衣不下定义为12 h 内[1]。分娩后奶牛的发病率为10%～25%，一些规模较小、养殖环境差的牧场甚至可高达50%左右，且环境温度高时发病率会增加[2]。目前已被证实，胎衣不下与子宫内膜炎、乳腺炎、酮病等风险增加有关[3]。胎衣不下会影响奶牛的生产和繁殖潜力，这给乳制品行业带来了巨大的经济损失。其带来的负面影响包括子宫复旧的延迟、妊娠率下降、屡配不孕等。目前为止，对于奶牛胎衣不下的研究已经深入到一定层次，涉及到了饲养管理、免疫调节、激素分泌、基因遗传等多个方面，但是仍未能准确的揭示胎衣不下发生的关键因素。胎膜排出的基础是胎盘成熟，之后妊娠晚期胎盘结构的变化，内分泌以及免疫学变化共同作用，最终使胎盘中血流减少乃至消失，进而使得子叶绒毛变小和塌陷，同时子叶与肉阜分离，最后经过子宫的收缩，从而使胎盘及时分离和排出[4]。而胎盘成熟的标志就在于母体胎盘与胎儿胎盘分离时上皮细胞的凋亡。Boos 等[5]研究发现，在发生胎衣不下的奶牛胎盘中，子宫内膜上皮细胞的凋亡数量显著降低。

奶牛在围产期易处于能量负平衡（negative energy balance，NEB）的状态，此时储存的体脂将以非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA）的形式被动员，导致血液中NEFA 的浓度增加。通过查阅资料得知，高浓度的NEFA 对动物和人类的生殖性能都有不利影响[6-7]；Swangchan-Uthai 发现产犊前最后7至10 d 的高浓度NEFA（>0.4 mM）与胎衣不下的风险增加相关[8]；Ospina 则发现在围产期期间，比起β-羟丁酸，NEFA 与胎衣不下的风险增加更为相关[9]，并且高浓度的NEFA 可诱导氧化应激从而使肝细胞凋亡[10]。故实验使用不同浓度的NEFA 刺激奶牛子宫内膜上皮细胞，来探讨NEFA 是否通过调节细胞凋亡因子的表达来损伤子宫内膜上皮细胞，进而影响胎衣不下的发生。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸购自美国Sigma 公司；RIPA 裂解液（强）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA 消化液购自上海索莱宝公司；胎牛血清购自四季青公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTMII 购自日本Takara 公司。

1.2 奶牛子宫内膜上皮细胞的培养

奶牛原代子宫内膜上皮细胞是由本研究室郑程远等[11]利用贴壁法分离培养的，经过纯化后，纯度可达90%以上。该细胞10 代以内的细胞活性较好，10代以后细胞活性下降，传代次数较多后细胞形态有所改变。故后续实验都采取10 代以内的细胞。

细胞复苏：冻存的细胞从液氮中拿出后迅速放入37 ℃水浴锅中摇晃，遵循“慢冻速溶”原则。直至剩一小块冰渣，拿出水浴锅摇晃至完全融化。将细胞冻存液转入15 mL 离心管，加入5 mL 含有血清双抗的RPMI1640 培养液，4 min、1 000 g 离心后弃上清。加入新的培养液混匀细胞团，然后按适当比例将细胞接种至细胞培养皿中，放入恒温培养箱内，次日换液，之后2 d 一传代，准备后续实验。

1.3 NEFA 的配置

配置10 mM 的NEFA 母液：取1.595 mM 棕榈酸、0.72 mM 硬脂酸、0.265 mM 棕榈油酸、2.175 mM油酸、0.245 mM 亚油酸，加到60 ℃预热过的0.1 mM KOH 中，充分震荡混匀，直至脂肪酸完全融化。取适量预热过的1 M HCl 和超纯水，加入到脂肪酸混合物中，调节其pH 为7.2。无菌条件下用0.22 μm 的滤器过滤分装，-20 ℃保存，使用时用含3%白蛋白的培养液稀释至工作液，现配现用。

1.4 CCK-8 检测细胞活性

将子宫内膜上皮细胞消化后按每孔2 万个细胞接种到96 孔板中，孔板外侧一周的孔内加入磷酸盐缓冲溶液培养液防止在培养箱内蒸发过多。培养约24 h 后，弃掉培养液，加入配置好的0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mM NEFA 加入96 孔板中，每个浓度5 个复孔，分别刺激12、24、48 h 后，弃掉旧液，加入含有10% CCK-8 试剂的无血清无双抗培养液，再培养孵育1 h。将96 孔板放入酶标仪中，选用450 nm测定OD 值，并根据公式：细胞活性=100%×［（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）］，计算细胞活性。

1.5 总RNA 的提取

实验中所有耗材皆为无RNA 酶耗材，在冰上操作。将子宫内膜上皮细胞消化后，按每孔25 万个细胞接种于6 孔板中，1.2 mM NEFA 刺激细胞12 h后，取TRizol 加入到实验孔中，每孔1 000 μL。裂解5 min 后吸取液体到EP 管中，每管加入200 μL 的氯仿，剧烈震荡混匀，4 ℃、12 000 g 离心10 min。小心吸取上层水相至新的EP 管中，加入200 μL 异丙醇，静置10 min 后4 ℃、12 000 g 离心10 min。弃上清，往管中沉淀加入75%的酒精，轻轻上下混匀，4 ℃、7 500 g 离心5 min。弃上清后再4 ℃、7 500 g 离心5 min，用枪头吸取残余的液体，最后晾干EP 管。往管中加入30 μL 的DEPC 水，拿去测定RNA 浓度。

1.6 qRT-PCR

使用PrimeScriptTMRT reagent Kit 将RNA 反转录成为cDNA，反转录体系见表1。将配置好的体系放入PCR 仪中，37 ℃15 min、85 ℃5 s，4 ℃冷却。得到产物-20 ℃保存。引物设计和购买来自上海生工生物工程有限公司，使用β-actin 为内参，qRT-PCR 法检测凋亡因子caspase 3、caspase 8、Bcl-2、Bax 的基因相对表达量，引物序列见表2，反应程序为：95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s、39 个循环；95 ℃10 s、melt curve 65 ℃to 95 ℃。2-△△ct法分析实验结果。

表1 反转录体系Table 1 The system of reverse transcription

表2 引物序列Table 2 The primer sequences of the genes

1.7 数据分析

结果为平均数±SEM 表示，使用SPSS 26.0 进行统计分析（ANOVA 分析），qRT-PCR 结果用独立样本T 检验分析显著性，“*”为差异显著（P＜0.05），“**”为差异极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 CCK-8 实验结果

不同浓度NEFA 刺激子宫内膜上皮细胞后，各个浓度下的OD 值如表3 所示：

表3 NEFA 处理子宫内膜上皮细胞后的吸光度Table 3 Absorbance of endometrial epithelial cells treated with NEFA

根据实验结果绘制不同浓度的NEFA 对子宫内膜上皮细胞活性影响的图，如图1 所示，随着NEFA浓度的升高，细胞活性先是小幅度的升高，然后下降，再小幅度的升高，之后随着浓度的升高细胞活性急剧的下降。在NEFA 浓度为1.2 mM 时，三个不同的时间处理组的细胞活性均显著下降（P＜0.05），而12 h 的细胞活性大于80%，24 h、48 h 时的细胞活性小于80%。有研究表明[12]，围产期奶牛体内NEFA 浓度平均为0.2～0.7 mM 左右，公认的妊娠末期NEFA含量的上限为0.4 mM，故本实验接下来选择0.2 mM为低浓度组、1.2 mM 为高浓度组，12 h 作为NEFA 的刺激时间。

图1 不同浓度NEFA 处理子宫内膜上皮细胞不同时间后的细胞活性Fig.1 Cell viability of endometrial epithelial cells treated with different concentrations of NEFA for different time

2.2 qRT-PCR 结果

如图2 所示，与对照组（NEFA 为0 mM）时相比，NEFA 在低浓度0.2 mM 时对细胞内caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax 的基因表达无显著影响，而NEFA在高浓度1.2 mM 时，极显著上调促凋亡基因caspase-3、caspase-8、Bax 的mRNA 表达（P＜0.01），显著下调Bcl-2 的mRNA 表达（P＜0.05）。

图2 NEFA 对子宫内膜上皮细胞caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax 基因表达的影响Fig.2 The effect of NEFA on the expression of caspase-3，caspase-8，Bcl-2 and Bax genes in endometrial epithelial cells

3 讨论

奶牛胎盘组织在妊娠晚期、分娩、胎盘分离和排出过程中发生一系列变化，包括细胞凋亡、细胞外基质重塑、免疫反应和炎症反应等，这些过程中的任何一个异常现已都被证实与胎衣不下的发生有关[13]。胎衣不下发病机理中目前比较认可的就是胎盘成熟假说，而胎盘的成熟依赖于母体和胎儿上皮细胞的低增殖和高凋亡。与妊娠期间相比，胎儿分娩后母体和胎儿上皮细胞中细胞凋亡调节因子的大量积累，表明细胞凋亡在正常分离和排出胎盘的过程中起着至关重要的作用[14]。凋亡的主要调节因子包括Fas、细胞表面死亡受体、Bcl2 家族蛋白和半胱氨酸蛋白酶（caspases）。Fas 是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，当其配体被激活时，Fas 会启动受体细胞的凋亡程序，caspase-8 通过两种途径对Fas 作出反应：高浓度的活性caspase-8 可以直接作用于下游的caspases，例如caspase-3，从而启动细胞凋亡。但是，如果caspase-8 含量低，则通过BID（Bcl2 家族的促凋亡成员）间接促使凋亡，BID 促进细胞色素C（CytochromeC，Cytc）入核，而最后激活caspase-8 促使细胞凋亡。在产犊后的几个小时内，胎盘中的Fas 的表达量增加，表明Fas-caspase-8-caspase-3 途径在胎盘排出中起到一定的作用[14-16]。且国内一些NEFA 对奶牛肝细胞损伤作用的研究中表明，高浓度的NEFA造成的肝细胞凋亡主要是通过激活c-Jun 氨基末端激酶和抑制细胞外调节蛋白激酶，由线粒体途径介导活化caspase-3、caspase-9 和Bax 的mRNA 表达水平，显著降低抗凋亡基因Bcl-2 的mRNA 表达水平。而从实验的结果可得知，高浓度的NEFA 刺激奶牛子宫内膜上皮细胞后，细胞内促凋亡基因caspase-3、caspase-8 和Bax 的mRNA 表达显著上调，而抗凋亡基因Bcl-2 的mRNA 却显著下降，说明NEFA 的确通过caspase 家族的一些因子诱导了子宫内膜上皮细胞的凋亡。

胎儿和母体上皮细胞的凋亡、胶原基质的降解和免疫反应后诱导的炎症反应是胎盘成熟的必要前提。例如，在分娩时，宫颈中促炎细胞因子白介素-8、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-10 的转录物的丰度比奶牛妊娠第185 d 至少高8 倍[17]。高浓度的NEFA 能够激活NF-κB 增加促炎因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-1β 的释放，从而导致牛肝细胞的损伤[10]；NEFA 还可以通过Toll 样受体4 信号通路来激活细胞的IκB 激酶，增强NF-κB 的转录活性，上调炎性因子IL-8、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量，从而导致子宫内膜上皮细胞损伤[18]。团队前期的研究发现，胎衣不下奶牛胎盘组织中基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）、MMP-9 的活性与胎衣正常排出的奶牛相比显著升高[19]。而MMP-2 和MMP-9 在胎盘中胶原蛋白的降解有着重要的作用[20]。故NEFA 可能通过多方面影响胎衣不下的发生。

综上所述，高浓度的NEFA 可以通过上调细胞凋亡因子的表达和抑制抗凋亡因子的表达来诱导子宫内膜上皮细胞凋亡，进而影响胎衣不下的发生。但是NEFA 调控胎衣不下发生的具体机制仍需进一步的研究。