簕菜提取物对酒精性肝损伤大鼠的保护作用

李冬梅，李志阳，杨 君，郝志明，杨 洁，林春华

（广东农工商职业技术学院热带农林学院，广东广州 510503）

簕菜，学名白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）又称苦刺（昆明、汕头）、三加皮（邵武、漳州、宁德）、三叶五加（台湾、日本）、鹅掌簕等，为五加科五加属的攀援灌木，多生于林缘、灌丛或山坡。簕菜主要分布于我国华南、西南、华中等地区，在马来西亚、新加坡、印度、日本等地也存在[1]。簕菜不仅作为民间常用草药，也是一种营养和保健价值都很高的野生蔬菜，据《本草纲目》记载，簕菜具有“解百毒”之称，可清热排毒、消暑解渴、解烟酒，具“久服轻身耐老”独特食疗功效[2]。因此是药膳两用蔬菜，是开发功能食品的理想原料，且安全无毒[3−5]。现代医学和食品营养学研究表明，簕菜的化学成分包括黄酮、酚酸、多糖、萜类、皂苷、挥发油等多种类型化合物，具有抗炎镇痛抗疲劳[6−7]、抑菌美白[8]、降血糖[9−10]、抗癌[11−12]、抗氧化[13]等多种活性作用和保健功效[14−15]。

随着饮酒人数及人均酒精消费量的增多，酒精性肝病的发病率逐年上升，无论是美国[16]、芬兰[17]、韩国[18]等发达国家还是我国[19]，酒精性肝病是造成肝硬化的主要病因。酒精性肝病己严重威胁到人类健康，成为全社会关注的一个重要公共卫生问题[20]。广东江门市恩平等地盛产簕菜，十多年前已经开始了人工种植，2015年，“恩平簕菜”入选国家农产品地理标志。据当地居民所言，食用簕菜有解酒和护肝的作用，但目前尚未有簕菜解酒护肝方面相关的研究报道。

本研究建立白酒致大鼠醉酒模型和大鼠急性酒精肝损伤模型，探讨簕菜醇提物、水提物的解酒护肝作用，从防醉酒、加速酒精代谢促解酒、增强机体抗氧化能力和减缓肝组织细胞损伤角度，研究簕菜对大鼠的解酒护肝作用，以期为进一步发掘簕菜的保健功能拓宽思路，也为簕菜解酒护肝保健功能食品的开发奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

簕菜茎叶 2020年7月采于广州市增城区中新镇校区东门试验田，种苗由广东恩平雪莊簕菜茶厂基地提供，品种为青梗；56°红星二锅头 北京红星股份有限公司；SPF级雄性SD大鼠 广东省医学实验中心，健康8周龄、体重200±20 g左右，许可证编号：SCXK（粤）2018-0002；苏木精 Solarbio公司；芦丁、没食子酸、齐墩果酸和葡萄糖标准品 上海源叶生物科技有限公司；海王牌金樽片 深圳市海王健康科技发展有限公司，批号20191205；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

JJ-2组织粉碎机 常州金坛良友仪器有限公司；723可见分光光度计 上海光学仪器一厂；HWS-24水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；DLSB-5L/10低温冷却液循环泵 巩义市予华仪器有限责任公司；RV3旋转蒸发仪 艾卡（广州）仪器设备有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海精其仪器有限公司；H1650R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；BPC-250F恒温培养箱

上海一恒科学仪器有限公司；Tecan Infinite 200 PRO多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；JB-P5包埋机、JB-L5冻台 武汉俊杰电子有限公司；RM2016病理切片机 上海徕卡仪器有限公司；KD-P组织摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；Donatello脱水机、Giotto染色机 意大利DIAPATH公司；GFL-230烤箱 天津市莱玻璃仪器设备有限公司；ckx53显微镜 日本OLUMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 簕菜提取物的制备

1.2.1.1 醇提物制备 称取经60 ℃电热恒温鼓风干燥10 h，组织粉碎机粉碎后过100目筛的簕菜茎叶粉30 g，置于圆底烧瓶中，加入270 mL 80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h，过滤残渣，重复提取1次，合并滤液，减压浓缩，将浓缩液于电热恒温鼓风干燥箱中进行干燥，得簕菜醇提膏状物。采用分光光度法[21]，以芦丁作标准品，测得簕菜醇提物中总黄酮为470.91 mg/100 g；采用福林酚法，以没食子酸为标准品，测得簕菜醇提物中总酚类为9.253 g/100 g；以齐墩果酸为标准品，测得簕菜醇提取物中总皂苷（以人参皂苷Re计）的含量为910 mg/100 g。

1.2.1.2 水提物制备 称量干燥粉碎后过100目筛的簕菜茎叶粉30 g，置于圆底烧瓶中，加入270 mL蒸馏水，80 ℃水浴回流提取2 h，过滤残渣，重复提取1次，合并滤液，减压浓缩，将浓缩液于电热恒温鼓风干燥箱中进行干燥，得簕菜水提膏状物。参照苯酚-硫酸法[22]，以无水葡萄糖作标准品，测得簕菜水提物粗多糖为105.2 mg/g。

1.2.2 大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的测定 取56只大鼠，实验前适应性饲养1周，随机分成8组，每组7只。8个组分别是：酒精模型组、阳性对照组（海王金樽）（0.27 g/kg），簕菜醇提物低剂量组（0.4 g/kg）、中剂量组（0.8 g/kg）和高剂量组（1.6 g/kg），簕菜水提物低剂量（0.4 g/kg）、中剂量（0.8 g/kg）和高剂量组（1.6 g/kg）。

各组大鼠禁食不禁水12 h，海王金樽组、簕菜提取物组分别按0.1 mL/10 g灌胃给予药物和不同浓度簕菜提取物，酒精模型组按照0.1 mL/10 g灌胃给予蒸馏水。30 min后，酒精模型组、阳性对照组、簕菜干预组按13 mL/kg体重用56o白酒灌胃。记录给酒、给药时间，以及大鼠翻正反射消失时间（以大鼠腹部朝上，背部朝下，如果大鼠能够保持该状态>30 s，说明大鼠的翻正反射消失，即醉酒）和翻正反射恢复时间（经过一段时间，大鼠能够翻身），计算酒精耐受时间（翻正反射消失时间−给酒时间）、睡眠时间（翻正反射恢复时间−翻正反射消失时间）、醒酒时间（翻正反射恢复时间−给酒时间）[23]。

1.2.3 大鼠血液中乙醇浓度和ALT、AST活性的测定 另取56只大鼠，分组及给受试物同“1.2.2”项，外加空白对照组，从灌胃白酒开始计时，分别在0.5、1、2、4 h对大鼠进行眼眶取血，每份血样取500 μL于10 mL离心管中，加入500 μL 20%三氯乙酸除蛋白，6000 r/min离心5 min，取上清液，采用酸性重铬酸盐氧化法[24]检测血液中乙醇的质量浓度。4 h眼眶取血，3000 r/min 4 ℃离心5 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定ALT和AST活性。

1.2.4 大鼠肝组织中各项指标的测定 另取56只大鼠，分组及给受试物同“1.2.2”项，每天给药1次，连续给药7 d，从给药第1 d起，每次给药后30 min，除正常对照组灌胃等体积蒸馏水外，其余各组动物均按13 mL/kg剂量灌胃56o白酒[25]。于第8 d处死大鼠，取出肝脏，制备肝组织匀浆，5000 r/min离心，取上清液，按照试剂盒说明书测ADH、ALDH和SOD活性及GSH、MDA含量，每只大鼠肝组织包埋1份样本后做HE检测。

1.3 数据处理

采用SPSS 26.0统计软件，实验数据结果采用（x ¯±s）表示，同一指标组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 簕菜提取物对大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的影响

由表1可见，与酒精模型组比较，除水提物低剂量组对酒精耐受时间无显著变化（P>0.05）外，阳性对照组、簕菜醇提物各剂量组和簕菜水提物中、高剂量组均可极显著延长酒精耐受时间，并缩短睡眠、醒酒时间（P<0.05，P<0.01）。但醇提物中剂量、高剂量组和水提物中剂量、高剂量组对大鼠酒精耐受、睡眠、醒酒时间的影响不存在量效关系，且簕菜醇提物防醉酒作用优于簕菜水提取物，其原因可能与簕菜醇提物中含有总黄酮、总多酚、总皂苷等多个解酒护肝功能组分有关。

2.2 簕菜提取物对大鼠血液乙醇含量的影响

如表2所示，与模型组比较，阳性对照组、簕菜醇提物低、中、高剂量组和簕菜水提物低、中、高剂量组在0.5、1、2、4 h时均可极显著降低大鼠血液中乙醇质量浓度（P<0.01）。簕菜提取物各剂量组均能降低大鼠血液中乙醇含量，其机制与大鼠肝脏中促进酒精代谢的ALD和ALDH酶活性升高有关（结果见2.4）。

表 1 簕菜提取物对大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的影响（x ¯±s，n=7）Table 1 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the drunkenness, sleep and sobering times of SD rats (x ¯±s, n=7)

表 2 簕菜提取物对大鼠血液中乙醇含量的影响（x ¯±s，n=7）Table 2 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the ethanol content in rat blood (x ¯±s, n=7)

2.3 簕菜提取物对大鼠血清ALT和AST活力的影响

由表3可知，与空白组比较，模型组大鼠血清ALT和AST活力极显著升高（P<0.01）；提示本实验采用白酒灌胃复制酒精性肝损伤模型建立成功，说明乙醇灌胃造模已造成大鼠肝细胞线粒体的损害[26]。与模型组比较，水提物低剂量组大鼠血清AST活力无显著变化（P>0.05），水提物中剂量组两者活力显著降低（P<0.05），阳性对照组和簕菜其它各剂量组两者活力极显著降低（P<0.01）。

在正常生理状态下，血清中ALT、AST的活性不高，但当肝功能异常以及肝细胞结构破坏，ALT、AST就会由破损处释放入血液，导致血中含量升高，肝中含量降低，临床上将血清中ALT、AST水平作为判断肝损伤程度的“金指标”[27−28]。表3结果表明，簕菜提取物能在一定程度上通过降低大鼠血清中的ALT、AST活力，减少酒精对肝细胞的损伤，起到较好的护肝作用，簕菜醇提物效果优于簕菜水提物，其原因可能是簕菜醇提物中含有总黄酮、总多酚、总皂苷等多个解酒护肝功能组分有关。

2.4 簕菜提取物对大鼠肝组织酒精代谢酶ADH和ALDH活性的影响

表4 可见，与空白组比较，模型组大鼠肝组织中ADH、ALDH活性极显著降低（P<0.01）；与模型组比较，阳性对照组、各簕菜提取物干预组均可极显著提高两者活性（P<0.01）。

人体摄入的乙醇约有90%是在肝脏内分解代谢的，乙醇在肝脏内可以被ADH、CAT等代谢系统氧化为乙醛，然后在线粒体中通过ALDH将乙醛催化为乙酸，乙酸以乙酰CoA进入三羧酸循环代谢，分解为二氧化碳和水[29]。因此，检测酒精代谢酶ADH和ALDH是评价药物解酒功能的重要方法[25]。以上结果表明，簕菜醇提物和水提物均能显著提高醉酒大鼠肝脏中酒精代谢酶ADH、ALDH的活性，促进酒精的代谢。

2.5 簕菜提取物对大鼠肝组织GSH、MDA含量和SOD活性的影响

表5 显示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织GSH含有量、SOD酶活力显著降低（P<0.01），而MDA含量极显著升高（P<0.01），表明酒精诱导肝细胞产生了一定程度的损伤。与模型组比较，阳性对照组、各簕菜提取物干预组中肝组织GSH含有量极显著增加（P<0.01），MDA含量极显著减少（P<0.01）。

正常肝脏内存在SOD、GSH能够清除自由基起到抗氧化的作用，而酒精的摄入引起自由基攻击健康肝细胞，消耗大量的SOD、GSH，同时会产生脂质过氧化物，其中MDA起关键作用，生成大量过氧化物的产物MDA[30]。以上结果表明，簕菜醇提物和水提物均能增强肝损伤大鼠肝脏的抗氧化能力，从而起较好的保肝作用。

表 3 簕菜提取物对大鼠血清中ALT和AST活力的影响（x ¯±s，n=7）Table 3 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the activities of ALT and AST in rat serum (x ¯±s, n=7)

表 4 簕菜提取物对大鼠肝组织ADH、ALDH活性的影响（x ¯±s，n=7）Table 4 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the activity of ADH, ALDH in rat liver tissue (x ¯±s, n=7)

表 5 簕菜提取物对大鼠肝组织GSH、MDA含量和SOD活性的影响（x ¯±s，n=7）Table 5 Effect of Acanthopanax trifoliatus extract on the contents of GSH,MDA and the activity of SOD in rats liver tissue (x ¯±s, n=7)

2.6 簕菜提取物对大鼠肝脏病理组织学变化的影响

由HE染色结果可以看出，空白对照组大鼠肝细胞形态正常，核结构清晰，肝细胞排列整齐，肝细胞索清晰，肝小叶结构清楚（图1A）；酒精模型组大鼠肝细胞弥漫性气球样变，胞浆疏松化，细胞核固缩，肝细胞灶状坏死（图1B）；阳性对照组大鼠肝细胞索排列整齐，肝窦正常，未见肝细胞坏死区（图1C）；簕菜醇提物低、中、高剂量组大鼠肝细胞肝细胞索排列尚整齐，肝细胞灶状坏死程度较轻（图1D、E、F）；簕菜水提物低、中、高剂量组大鼠肝细胞索排列尚整齐，肝窦正常，肝细胞灶状坏死程度较轻（图1G、H、I）。以上结果表明，海王金樽、簕菜醇提物和水提物均能一定程度减轻酒精对肝细胞损伤，其中海王金樽、高剂量簕菜醇提物、高剂量水提物对酒精性肝损伤的缓解作用较佳。

图 1 簕菜提取物对急性酒精中毒大鼠肝脏病理形态学变化的影响（HE, 400×）Fig.1 Effects of Acanthopanax trifoliatus extract on the pathological changes of liver in rats with acute alcoholism (HE, 400×)

3 结论

研究结果表明，簕菜醇提物和水提物均可显著延长大鼠酒精耐受时间，缩短睡眠、醒酒时间（P<0.05），对延长大鼠酒精耐受时间方面，醇提物的效果优于水提物；簕菜醇提物和水提物均可降低大鼠血液中乙醇质量浓度，提高大鼠肝组织中乙醇代谢酶ADH和ALDH的活性；两种提取物均能显著抑制酒精引起的大鼠血清ALT和AST活性升高（P<0.05），对降低AST活性而言，醇提物的效果优于水提物；两种提取物均可使大鼠肝脏组织GSH含量升高，MDA含量降低，SOD活性增强；两种提取物均可在一定程度上减轻酒精引起的肝细胞变性程度。总体而言，簕菜醇提物的解酒护肝作用优于水提物，这与野葛叶[23]的研究结果相似。已有研究结果表明，对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健食品最常用的5种功效成分分别是总黄酮、粗多糖、葛根素、总皂苷、牛磺酸[26]。由此推测，簕菜醇提物的解酒护肝作用优于水提物，可能是簕菜醇提物中含有较高含量总黄酮、总多酚、总皂苷等功效成分，这些成分共同作用，而簕菜水提物的主要功效成分为粗多糖的原因所致。

综上所述，簕菜提取物通过加速乙醇代谢促解酒、增强机体抗氧化能力和减缓肝组织细胞损伤等方面，从而起到较好的解酒护肝作用。本研究为簕菜提取物的合理开发利用提供了理论依据。今后，可对簕菜醇提物、水提物进一步筛选，对其解酒护肝活性组分进行深入研究，明确其有效功能成分，开发簕菜解酒护肝功能食品。