微波加热对乳清分离蛋白功能特性的影响及机制研究

郭扬凯，陈丽丽，冯娇娇，刘雪梅，赵 利，白春清,

（1.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013；2.江西科技师范大学，有机功能分子研究所，江西南昌 330013）

美拉德反应又称“非酶褐变反应”，是基于蛋白质的ε-氨基与多糖还原性末端上的羰基之间发生的接枝反应[1]。该反应不需要任何化学试剂作为催化剂，食品加工中仅加热就可使该反应自发进行，使蛋白质与糖共价结合。美拉德反应接枝后，可提高蛋白的溶解性、乳化性及抗氧化活性。作为一种具有发展潜力的蛋白质化学改性技术，美拉德反应受到国内外研究者的普遍关注[2−4]。但传统的美拉德改性方式如：水浴加热、烘箱加热等方式，往往存在反应时间长、受热不均、能耗高等缺陷。微波加热作为新型的加热技术，其作用原理是通过加热体内部偶极分子高频往复运动将微波能转变成热能，具有加热速度快、热量损失小、操作方便、加热均匀等优点，可以缩短工艺时间、提高生产效率、降低成本[5]。微波功率大小及微波加热时间长短是影响加热快慢的关键因素，同时pH的高低也是影响美拉德改性的主要因素[6]。目前关于微波提取及微波杀菌方面的研究报道较多，而关于微波法进行美拉德反应改性的研究较少[7]。

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀后存在于乳清中的天然蛋白质，研究发现其安全无毒，消化利用率高（95%以上），营养丰富，且具有良好的乳化性能，被广泛应用于乳品、焙烤食品等领域[8−11]。但天然蛋白的一些缺点如抗氧化性有限，在等电点附近溶解性差、乳化性不理想等，限制了其在食品工业特别是在乳化包埋体系中的进一步应用[12]。

因此，本研究拟采用微波加热处理促进美拉德反应对乳清分离蛋白进行改性，研究主要因素（微波功率、微波加热时间、pH及糖-蛋白质比例）在微波处理过程对乳蛋白功能性质（乳化性、抗氧化性）的影响，优化改性工艺，并对反应进程中二级结构变化及氨基酸组成进行深入分析，探讨作用机制，以期为微波加热在蛋白质化学改性中的进一步应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清分离蛋白（蛋白含量91%~92%） Glanbia公司；乳糖、大豆油、十二烷基硫酸钠（SDS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司

BSA224S-CW型电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；T25高速剪切乳化机 德国IKA集团；JB-3型磁力搅拌器 上海雷磁新径仪器有限公司；UV-2600紫外分光光度计 上海仪器有限公司；微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司；FTIR Nicolet5700 红外 美国Nexus仪器公司；HITACHI L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 美拉德反应产物制备 参照Kim等[13]的方法稍作改进。称取一定量的WPI溶于蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL WPI溶液，按质量比5:5称取乳糖，充分搅拌溶解后，用0.1 mol/L NaOH调至pH8.5，分装到50 mL玻璃样品瓶后置于微波炉中，在560 W功率下加热反应9 min后，立即取出冷却至室温，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 乳化性评价 通过测定样品的乳化活性及乳化稳定性评价其乳化性：称取MRPs，溶解于去离子水中，配成蛋白浓度为1 mg/mL的溶液。在常温下搅拌1 h后，取9 mL MRPs溶液与1 mL大豆油混合，放入50 mL离心管中。在机械乳化机下乳化1 min（转速12000 r/min），取样点固定在离离心管底部0.5 cm处，取50 μL的乳化液与5 mL，0.1%的SDS混合，在500 nm处测定样品吸光度值A0，用0.1%的SDS做空白对照。

以乳化活力指数（Emulsification Activity Index,EAI）表示蛋白的乳化活性：

式中：N：稀释倍数=100，C：乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度（g/mL），2.303：换算常数，φ：乳化液中油的体积分数（V/V，φ=0.10）。

静置10 min后重新取样测定吸光值（A10），乳化稳定性用乳化稳定指数（Emulsifying Stability Index,ESI）表示：

1.2.3 抗氧化活性的测定 0.1 mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH 10 mg，用无水乙醇溶解并定容至250 mL棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液（0.1 mmol/L），避光保存，备用。1 mg/mL美拉德产物（以WPI含量计）样品液的配制：按照反应前蛋白质量为依据，配制蛋白含量为1 mg/mL的美拉德产物样品液。测定：取配制好的样品溶液2.0 mL，置于10 mL试管中，加入2.0 mL的DPPH溶液，室温避光反应30 min，同时分别以蒸馏水、无水乙醇替代样品、DPPH溶液作为试剂空白，于517 nm波长处测定吸光值。DPPH自由基清除率计算：按下列公式计算各浓度样品对DPPH自由基的清除率：

式中，A0：2.0 mL蒸馏水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A1：2.0 mL样品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A2：2.0 mL样品溶液+2.0 mL无水乙醇的吸光度值；试剂空白：2.0 mL蒸馏水+2.0 mL无水乙醇。

1.2.4 制备条件对MRPs功能特性的影响 蛋白质的功能性质取决于美拉德反应的进程，而制备条件又是影响反应体系的关键因素[14−16]。本研究在前期实验研究的基础上，采用固定单一变量法，系统研究微波条件（微波加热时间、功率）、pH、复合物比例对MRPs乳化性和抗氧化活性的影响。

1.2.4.1 微波加热时间、功率对MRPs功能特性的影响 固定乳糖与WPI质量比为5:5，反应混合物pH为8.5，分别考察微波加热时间（0、1、3、5、7、9、11、13、15 min）及微波功率（320和560 W）对WPIMRPs乳化性及抗氧化活性的影响。

1.2.4.2 pH对MRPs功能特性的影响 固定乳糖与WPI质量比为5:5，微波功率560 W，考察不同反应pH（7、7.5、8、8.5、9）条件下，分别加热7和9 min对WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影响。

1.2.4.3 乳糖与WPI质量比对MRPs功能特性的影响 固定微波功率560 W，反应混合物pH为8.5，考察微波加热时间7 min，乳糖与WPI质量比（5:3、5:4、5:5、5:6、5:7、5:8）对WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影响。

1.2.5 正交试验 根据单因素实验，选取影响较大的三个因素（A微波加热时间、B pH、C WPI与乳糖质量比），以ESI为主要指标按照表1做L9（34）工艺正交设计，筛选对MRPs乳化性改善最佳的反应条件。

表 1 L9（34）正交设计因素水平Table 1 Factor and level of L9(34) orthogonal design

1.2.6 红外光谱分析 称取适量样品，进行冷冻干燥后，按质量比1:100分别与光谱纯KBr混合，于玛瑙研钵（红外专用）中充分均匀，压成薄片后，用傅立叶红外光谱仪对不同加热时间（0、3、7、15 min）作全波长（4000~400 cm−1）扫描。利用Omnic 6.0软件对酰胺I带图谱（1700~1600 cm−1）进行基线校正，二阶求导，去卷积处理，并采用Origin软件对去卷积后图谱进行Gaussian拟合，得到各子峰，进行峰的归属及各子峰峰面积百分含量计算。

1.2.7 氨基酸分析 样品经浓盐酸水解22 h后，旋蒸排酸，再过0.22 μm水系滤膜，用氨基酸自动分析仪（HITACHI L-8900型）测定氨基酸组成。

1.3 数据处理

各组数据均为3次实验的平均值±标准偏差，并采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 制备条件对MRPs功能特性的影响

2.1.1 微波加热时间、功率对MRPs功能特性的影响

2.1.1.1 微波加热时间、功率对MRPs乳化性的影响

微波加热时间、功率对WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影响如图1所示。图1A、图1B显示，MRPs的乳化性及乳化稳定性随着微波加热时间的延长呈先升高后降低的趋势，并在9 min左右达到顶峰。据文献所述，美拉德反应是一个连续进程，整个反应大致分成初期、中期和后期三个阶段，在反应初期，水溶性糖的引入可使蛋白质的空间结构发生改变，促使处于蛋白质内部的疏水性基团暴露出来，在油-水界面发生变性，并伸向油相内部，而糖份因其亲水性附着在蛋白膜表面，提高蛋白质乳化性的同时，增强了界面膜的稳定性，有效阻止油滴的聚集，使乳化稳定性增强[14]；当反应进入中后期，随着交联程度的升高，一方面，因破坏了双亲性的平衡，MRPs的界面活性大大降低，乳化性下降；另一方面，过度反应产生的蛋白交联聚集，会生成一定的不溶物，使体系溶解度下降，溶解性降低，乳化性降低[15]。同时，实验过程中也发现，随着反应时间的延长，体系前期颜色变化较少，而后期颜色加深，并出现褐色，说明反应进行到了中后期，且出现了焦糖化反应。以上研究结果与其他相关研究学者的结论基本一致，如：胡坤等[16]发现大豆分离蛋白和麦芽糊精的糖基化反应产物的乳化性随着反应时间的延长经历了从上升到下降的过程；O’Regan等[17]指出美拉德反应初期得到的产物较为温和，不仅不会减弱蛋白质的功能性质，反而能改善乳化性能，因此，要控制反应过程。

320、560、800 W为微波炉可调节的三个常用功率，因本实验所用样品为液态，800 W加热功率过大，液体容易溅出，固选择320、560 W两个加热功率展开研究[18]。不同微波功率对MRPs乳化性方面的影响结果显示，高、低微波功率加热处理样品的ESI和EAI测定值随加热时间的变化趋势基本一致，但560 W条件下样品的ESI和EAI均高于320 W条件下的测定值，且高微波功率下MRPs的ESI和EAI峰值出现时间明显早于低微波功率的测定值，说明微波功率的提高会加剧美拉德反应的进程。这可能是高功率有利于体系快速的升温，从而加剧分子间的相互作用，使美拉德反应更容易发生[19]。在美拉德反应初期，蛋白质的氨基与还原糖的醛基之间发生Shiff碱环化反应，后经Amadori重排形成Amadori化合物[20]。微波加热属于内发式加热，体系的物理性质（介电常数、密度、粘度、比热等）及微波功率是影响升温速度快慢的重要因素[21]。在物料固定的条件下，其升温速度主要受控于微波功率，微波功率高，则促使体系中的极性分子以更快的速度进行运动摩擦生热，并快速升温，因此，高功率处理组的乳化性升高速度较低功率处理组快；另一方面，温度越高，初期所生成的Amadori化合物进行脱水、降解的速率也越快，从而使美拉德反应较快地进入中后期，最终导致乳化性的拐点（560 W，7 min）较低功率处理组（320 W，9 min）有所提前[21]。

2.1.2 微波加热时间、功率对MRPs抗氧化活性的影响 抗氧化活性是基于美拉德反应接枝产物的重要功能特性之一[22]。为了考察微波加热时间、功率对美拉德反应复合物抗氧化能力的影响，本研究以乳清蛋白为对照，跟踪监测了乳糖-乳清蛋白体系分别在320和560 W微波加热不同时间复合物对DPPH自由基清除率的能力大小，结果如图2所示。可清晰地发现，随着美拉德反应时间的延长，MRPs的DPPH自由基清除率逐渐增加，且高功率加热组的测定值普遍高于低功率加热组的测定值，如经560、320 W分别加热15 min后，DPPH自由基清除率由最初的1.29%分别达到12.17%和9.32%。美拉德反应产物是一个复杂的混合物，体系抗氧化能力的大小与复合物组成有很大关系，其中美拉德反应终产物—类黑精为主要的抗氧化物质、Amadori产物的热分解时生成的还原酮类化合物以及硫醇类杂环化合物具有一定的抗氧化活性，美拉德反应高级阶段产生的N、S的挥发性杂环化合物，氢基以及吡咯也有抗氧化活性[23]。因此，本研究微波加热处理可提高蛋白质的抗氧化活性可能由于微波加热促使蛋白质分子结构伸展，提高了美拉德反应速率，产生更多具有较高抗氧化活性的中间产物和高级产物，加热时间越长，产生的产物越多，抗氧化活性越高；而较高微波功率会使得更多蛋白分子伸展，从而促进反应的发生，生成更多的具有抗氧化性的产物。

图 2 微波加热时间、功率对MRPs抗氧化活性的影响Fig.2 Effects of microwave heating time and power on antioxidant activity of MRPs

图 3 pH对MRPs乳化稳定性（A）和乳化活性（B）的影响Fig.3 Effects of pH on ESI（A）and EAI（B）of MRPs

2.2 pH对MRPs功能特性的影响

2.2.1 pH对MRPs乳化性及乳化稳定性的影响pH是影响美拉德反应进程的一个重要参数[24]。一般来说，当体系在酸性条件下，蛋白质分子中的氨基处于质子化状态，糖碱基C1因受正电荷的影响更易于进行1、2-烯醇化转化，而难以进行葡胺缩合反应，且其缩合产物易于水解，因而，酸性条件不利于美拉德反应的进行；当体系处于碱性条件下时，糖碱基C1上电子云密度增大，体系更易于2,3-烯醇化反应生成还原酮类和脱氢还原酮类，即碱性条件易于美拉德反应的进行[25]。为了获得较适宜的pH条件，考察了体系经五个pH：7、7.5、8、8.5、9分别微波加热7、9 min后的乳化活性性及乳化稳定性，结果图3所示。从图3中可清晰地发现，虽微波加热时间不同，pH对乳化性的影响整体一致，即随着pH的升高（pH7~8.5），ESI都呈先升高再降低的趋势，EAI都呈整体上升趋势。美拉德体系成分多且反应复杂，在美拉德反应过程中，一方面，因亲水性糖分子的引入，蛋白质自身的亲水/疏水平衡被打破，蛋白质亲水性提高，分子内部疏水基团暴露，油-水界面的相互作用提高（蛋白质乳化大豆油），乳化活性增强的同时，界面膜的厚度和机械强度增加，乳化稳定性提高；另一方面，温度过高，反应过于剧烈，也会使蛋白质高度变性，结构及内部基团被破坏，出现蛋白质聚集、絮凝，乳化性能降低[26−27]。在pH7~8.5范围内，ESI和EAI都随着碱性条件的增强而升高，说明碱性环境易于乳糖与WPI间的接枝反应，且多糖分子的空间位阻效应一定程度上减少了WPI分子间的热聚集。而pH9.0时，乳化稳定性下降，可能是过碱环境在促进美拉德反应接枝的同时也加速了反应终产物的产生，外加蛋白质间的热聚集的综合影响，导致复合物乳化性能降低[15,25]。同时也发现，相同pH条件下（7~8），长时间加热组的乳化活性及乳化稳定性均高于对应短时间加热组的测定值，而当pH升至8.5~9时，短时加热组的测定值反而高于长时间加热组。反应条件（温度、pH、时间、蛋白质与多糖比例等）都是影响美拉德反应进程的常见因素[15]。一方面，微波加热时间越长，体系所受的高温加热时间越长，在低pH条件下，pH高低为接枝改性的关键受控因素，微波加热时间越长，体系所受的高温加热时间越长，接枝反应越彻底，乳化性能越好。而高pH具有促进反应进程的作用，体系产生最佳乳化性能复合物所需时间缩短，加热时间过长，体系产生更多中后期产物，体系乳化性能降低。

2.2.2 pH对MRPs抗氧化活性的影响 在前期微波功率、时间对MRPs功能特性的影响实验中，发现7、9 min在选定的微波功率（560 W）下，乳化性后者略低于前者，而其抗氧化活性高于前者，为了综合系统研究pH对MRPs功能特性的影响，设定加热时间分别为7、9 min进行了研究。图4显示不同加热时间下，MRPs自由基清除率随着pH的变化规律基本一致，即随着pH的升高自由基先升高后降低，其中在pH7~8.0之间自由基清除率上升幅度较大，从3.86%升高至6.34%（加热7 min），在pH8~8.5之间上升幅度较小，当pH为9.0时，测定值低于8.5测定值。在pH为8~9范围内测定值波动不大，基本保持恒定。同时也可发现，同一pH下，长时间加热组的自由基清除率普遍高于短时加热组的测定值，如pH8.5时，加热7和9 min的自由基清除率分别为6.60%和7.26%，且在pH9.0时，都呈现微弱的降低趋势。低pH条件下，清除率的升高可能源于碱性条件易于美拉德反应的进行，从而产生较多的中间产物，抗氧化活性提高；而8~8.5可能为较适宜的pH反应条件，美拉德反应进程差别较小，产物组分较为类似，自由基清除率差别不大；而过碱环境可能加速了反应的进程，使体系在加热7 min时已经产生了大量的反应终产物，并促进了终产物的分解，产生了一定量的抗氧化性相对较弱的产物，而使体系抗氧化性有所降低[25]。

图 4 pH对MRPs抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of pH on antioxidant activity of MRPs

2.3 乳糖与乳清蛋白质量比对MRPs功能特性的影响

2.3.1 乳糖与乳清蛋白质量比对MRPs乳化性的影响 由图5、图6可以发现，随着乳糖比例的增加，MRPs的乳化稳定性指数（ESI）和乳化活力指数（EAI）呈现先升高后下降的趋势，并且在乳糖与乳清粉质量比为5:5时，乳化活性及乳化稳定性达到最佳状态。研究表明，美拉德反应程度高低与还原糖含量大小有关，在蛋白质质量固定的条件下，还原糖添加量越大，被接枝的氨基就越多，在进行乳化性评价过程中，MRPs在油-水界面可以更加有序紧密的排列，从而形成更为致密的蛋白膜，因此其乳化性得以提高；但当还原糖添加量过高时，生成大量中间产物和类黑精等不具备双亲性质的物质越多，导致乳化性能下降[14−15]。

图 5 乳清蛋白与乳糖质量比对MRPs乳化稳定性的影响Fig.5 Effect of the ratio of whey protein to lactose on the emulsion stability of MRPs

图 6 乳清蛋白与乳糖质量比对MRPs乳化活性的影响Fig.6 Effect of the ratio of whey protein to lactose on the emulsifying activity of MRPs

2.3.2 乳糖与乳清蛋白质量比对MRPs抗氧化活性的影响 图7显示了美拉德复合物DPPH自由基清除率随不同乳清蛋白-乳糖质量比的变化，根据图像显示，当增大乳清蛋白-乳糖质量比时，MRPs DPPH自由基清除率也跟着增加，在质量比为5:5时达到最大，而随着乳糖加入量的继续增加，MRPs DPPH自由基清除率反而逐渐减小。这种变化趋势与乳化性的变化趋势较为类似。乳糖添加量的提高易于美拉德反应的进行，从而产生较多具有抗氧化活性的物质，从而提高自由基清除率；而过多的乳糖反而减低了接枝反应的速率，而导致反应产物较少，抗氧化性下降[23]。

图 7 乳清蛋白与乳糖质量比对MRPs抗氧化性的影响Fig.7 Effect of weight ratio of whey protein to lactose on the antioxidant activity of MRPs

2.4 正交试验

根据单因素实验，得知加热时间、乳糖-乳清粉质量比和pH对美拉德反应复合物的乳化性影响较大，本研究以ESI为主要指标进行了L9（34）工艺正交实验，结果如表2所示。

表 2 L9（34）工艺正交试验设计结果Table 2 Result of the L9(34) orthogonal experiment

从极差分析能得出，影响MRPs乳化稳定性指数的各因素主次顺序为：pH>时间>乳清蛋白与乳糖质量比。根据Ki值，得到MRPs乳化稳定性指数的最佳条件为A2B2C2，即：加热时间7 min、pH为8.5、乳清蛋白与乳糖质量比为5:5。同法，以DPPH自由基清除率为指标开展的正交试验（数据未显示，设定反应时间水平为11、13、15 min，其他条件同乳化性因素水平表）得知，对MRPs DPPH自由基清除率影响最大的因素为微波加热时间，其次为pH，最后是乳清蛋白-乳糖质量比，获得具有较高抗氧化活性MRPs DPPH的最优反应条件为：pH8.5、乳清蛋白-乳糖质量比5:5、反应时间15 min。因此，综合分析可以确定pH8.5、乳清蛋白-乳糖质量比5:5为高乳化性、抗氧化活性MRPs较优的制备条件；但对MRPs DPPH自由基清除率而言，反应时间越长，抗氧化活性越高，而伴随着加热时间的延长，较多中后期产物产生，体系乳化性降低，综合考虑选定加热时间7 min；确定制备兼具抗氧化活性，乳化活性的MRPs条件为pH8.5、乳清蛋白-乳糖质量比5:5、反应时间7 min。在该条件下制备所得MRPs的EAI、ESI和DPPH自由基清除率分别为0.35 m2/g、88.39 min和6.60%。

2.5 红外吸收光谱

红外吸收带的波数位置、波峰的数目以及吸收谱带的强度反映了分子结构上的特点，可以用来鉴定化合物的结构组成或通过分析功能基团特征谱带的变化推测化合物之间的相互反应[28]。当还原糖与蛋白质发生美拉德反应后，主要的变化特征是分子中的N-H和C=O数量明显的增加。具体表现在：a.在WPI中因N-H变形振动或羟基伸缩振动产生的3700~3200 cm−1范围内较宽的谱带经微波加热后向低波数方向移动，并伴随谱带变宽强度变大，且最大吸收峰由原来的3411.57 cm−1处移至3393.76 cm−1处，这可能是由于新物质共价交联出现了新的NH键所致；乳清蛋白在1651 cm−1酰胺Ⅰ带的尖锐吸收峰主要是因C=O键面内伸缩振动引起，且微波处理后最大吸收波长向低波数方向移动，与未加热处理组相比，微波加热3 min与7 min样品波数有所降低，但二者间差异不大，微波加热15 min后最大吸收波长有所降低，且在1610 cm−1附近出现新的吸收峰。在酰胺Ⅲ带1400 cm−1左右同时出现的尖锐的吸收峰（图8），主要是C-N伸缩振动和N-H面内变形振动引起的，反应后吸收明显增强且加宽，说明CN键明显增多，即还原糖以共价键的形式连接在了WPI的N-H上。900 cm−1附近的吸收峰表示不饱和键的多少，微波处理3 min后这个波数附近峰的形状有几乎没有变化，随着微波加热时间的延长，原本位于894 cm−1附近的吸收峰向低波数方向移动，并在925 cm−1处出现新的吸收峰（7 min），这可能是美拉德反应产生的一些烯醇等中间体，而微波处理15 min后，在该处的吸收峰强度明显加大，这可能与糖基化产物裂解产生较多的不饱和醛酮类物质有关[21]。

图 8 不同加热时间的MRPs红外光谱Fig.8 Infrared spectra of MRPs after heated for different time

图 9 MRPs酰胺Ⅰ带的红外光谱及高斯曲线拟合图Fig.9 Infrared spectra and Gaussian fitting curves in amide Ⅰ region of MRPs

综上所述，微波加热过程中，乳糖与WPI通过共价键发生缔合，随着加热时间的延长产生了复杂的美拉德中间产物和醛酮类化合物。

图9 为MRPs 酰胺Ⅰ带的红外光谱及高斯曲线拟合图。反应起始时，体系α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲，分别为26.47%、27.85%、18.73%、26.96%，随着加热时间的延长，α-螺旋呈整体上升趋势，而β-折叠有明显的降低，β-转角和无规则卷曲结构变化趋势有点复杂。其中，微波加热3 min样品与0 min相比，可发现α-螺旋略有降低，β-折叠降低了4.19%，而β-转角升高了8.90%，无规则卷曲降低了2.73%；加热7 min样品二级结构与3 min相比，除β-折叠有所降低，其他二级结构变化不大；而热15 min后，α-螺旋升高至30.63%，β-折叠持续降低至16.65%，β-转角又降低至25.05%，无规则卷曲略微升高至27.67%。α-螺旋和β-折叠属于紧密有序结构，β-转角属于比较松散的部分有序结构，而无规则卷曲为松散的无序结构[29]。由表3可知，未微波前，α+β结构占比高达54.32%，即此时乳清蛋白分子内部主要由紧密有序结构组成，分子内部的氢键作用力较强。随着微波加热时间的延长乳清蛋白分子中α+β结构占比呈降低趋势，加热15 min后，占比降至47.28%，说明微波加热促使蛋白质结构由紧密向松散结构转化呈现出“溶胀”状态，在转变的过程中，涉及到大部分紧密有序结构首先转变成松散有序结构，进而转变成松散无序状态，并可能伴随小部分紧密结构经长时间加热后相互转变（有待进一步验证）。

表 3 MRPs酰胺Ⅰ带谱带指认结果Table 3 Band assignments in the amide Ⅰ spectral region of MRPs

2.6 氨基酸含量分析

组成蛋白质的氨基酸有20多种，但绝大多数的蛋白只有20种氨基酸组成[30]。本研究采用盐酸水解蛋白质制备氨基酸溶液，并对其进行测定。表4显示：微波加热0、7、15 min后，总氨基酸含量分别为162.850、149.173、144.950 nmol/L，即随着反应时间的延长，总氨基酸含量呈减少的趋势，这与之前的研究报道较为一致[18]。从氨基酸组成来看，20种常见氨基酸中，半胱氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺（表中未列出）未被检出，可能是盐酸破坏了上述氨基酸结构所致[18]；微波加热后大部分氨基酸含量有所降低，且微波加热时间越长含量越低，如：甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸；而脯氨酸经微波加热后含量略有升高；其它氨基酸如天门冬氨酸、苏氨酸等则变化较为复杂。张兰[18]曾开展的微波加热对酪蛋白-乳糖混合物总氨基酸分析结果表明微波处理会降低体系的总氨基酸含量，且微波功率越大，总氨基酸降低幅度越大，这可能是游离氨基酸参与了美拉德反应，并在反应中转变成其他物质所致[21,25]。有研究报道[31]认为因赖氨酸和精氨酸分子上存在参与美拉德反应的ε-氨基，导致美拉德反应进程中其含量有所降低。因美拉德反应较为复杂，在反应的进程中是否存在氨基酸降解、其降解历程如何等系列问题，有待进一步研究。

表 4 样品氨基酸组成测量成果Table 4 Amino acid composition results

3 结论

以ESI、EAI及DPPH自由基清除率为指标，系统考察了微波功率、时间、pH、乳糖与乳清蛋白质量比等Maillard反应的主要参数对MRPs功能性质的影响，结合正交试验结果，综合分析确定获得较高乳化性、抗氧化活性的微波条件为：微波功率560 W，pH8.5，乳糖与乳清蛋白质量比5:5，微波加热时间7 min。红外分析结果表明乳糖与WPI进行了共价结合，微波加热促进了该反应的进行，并产生了负责的中间产物及醛酮类化合物；氨基酸测定结果显示微波反应会降低体系总氨基酸含量；但是反应过程中蛋白质二级结构是否存在相互转化，是否存在氨基酸的降解及其降解历程如何等问题有待进一步证实。