SPME-GC-MS结合ROAV分析腌制时间对大河乌猪火腿挥发性风味物质的影响

王 藤，施娅楠，李 祥，黄艾祥,

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南东恒经贸集团有限公司，云南曲靖 655000）

大河乌猪因其肉质好、营养丰富、风味独特闻名[1−2]。大河乌猪火腿是采用10 kg以上的新鲜后腿为原料，经预冷排酸、上盐腌制、脱水平衡、挂晒发酵等加工而成。风味是干腌火腿最重要的指标之一，不同挥发性风味物质的组成赋予产品不同的风味特征[3]。有关火腿风味的研究主要采用气相色谱-质谱联用技术、气相色谱-嗅味计技术及电子鼻技术等。Théron等[4]利用GC-MS结合GC-O分析及鉴定巴约那火腿中的挥发性物质和气味活性成分。食品的挥发性化合物不仅与含量有关，还与感觉阈值有关。相对气味活度值（ROAV）法是一种确定食品中关键挥发性化合物的方法[5]；Sun等[6]通过ROAV法确定了炖鸡的风味成分。

目前，许多学者对宣威火腿、金华火腿中的理化成分、挥发性风味物质[7−9]、加工工艺进行了研究[10−12]，而对大河乌猪火腿的研究却很鲜见，Shi等[13]揭示了大河乌猪火腿腌制24 d后自然发酵过程中风味化合物的变化。其次，腌制具有改善肉的色、香、味，防腐的作用，有关肉制品腌制的报道主要集中于比较不同腌制方式对肉制品的腌制效果[14]及腌制对肉制品食用品质的影响[15]，而腌制时间对肉制品风味物质影响的研究鲜有报道，谭汝成[16]研究表明腌制能促进前体物质的转化和风味物质的形成。

因此，本研究采用SPEM-GC-MS结合ROAV对大河乌猪干腌火腿在4个不同腌制时间（15、18、21、24 d）加工过程中的挥发性化合物进行鉴定，研究不同腌制时间对挥发性化合物的变化及形成的影响，以期为大河乌猪干腌火腿加工工艺优化及品质控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大河乌猪火腿10±1 kg，云南东恒经贸集团有限公司提供；甲醇色谱级 美国Sigma公司。

含SPME装置的多功能样品处理平台、SPME萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS） 美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大河乌猪干腌火腿的生产 新鲜后腿：10±1 kg的大河乌猪鲜后腿；

预冷排酸：3±1 ℃、RH=85%~90%室内冷凉18 h以上，使腿中心温度3~4 ℃；

俢割整形：用快刀剔除“吊肉”，刮尽残毛，挤出血水，将腿修割成椭圆形、肌肉外露；

低温上盐腌制：采用上盐堆码干腌腌制，按每只鲜腿重的5.5%称取食盐，再按食盐总重50%、30%、20%的比例，分别在第1、3、15 d搓揉上盐并翻堆后堆码腌制，腌制条件（3±1 ℃、RH=85%）；

中温脱水平衡：60 d，6±1 ℃、RH=75%~80%；

高温发酵产香：270 d，23±1 ℃、RH=65%；

质检成品。

1.2.2 火腿采样 从腌制时间为（15、18、21、24 d）的4个组中分别随机抽取4只火腿样品，共计16只，将半膜肌和股二头肌混合，真空包装并保存在

−20 ℃。

1.2.3 SPME-GC-MS联用技术分析顶空固相微萃取条件 参照Huan等[17]的方法，称取已搅碎的肉样5.00 g于20 mL顶空瓶中；将老化后的萃取头插入顶空瓶上部，50 ℃吸附40 min，210 ℃解析5 min。

GC条件参照高韶婷等[18]的方法，略做修改。色谱柱：DB-5 MS毛细色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升至250 ℃并保持7 min；载气He（纯度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样量0.5 μL；分流比1:30。

MS条件传输线温度280 ℃，离子源EI，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，数据采集模式为全扫描（Scan），质量扫描范围m/z 50~450 amu。

1.2.4 挥发性风味物质的鉴定 挥发性物质的定性：挥发性化合物利用NIST08.L谱库的标准质谱图对得到的谱图数据进行串联检索和人工解析，获得未知化合物与质谱库中已知化合物的匹配度，匹配度大于80即初步确定未知物为该物质。

挥发性物质的定量：采用峰面积归一化法[19]。

关键挥发性物质评定方法：采用相对香气活度值法（relative odor activity value，ROAV）[20]。

式中：ROAVi为某挥发性风味物质的相对气味活度值；Ci为某挥发性风味物质的相对含量；Tstan为气味贡献最大挥发性风味物质的阈值；Cstan为气味贡献最大挥发性风味物质的相对含量；Ti为某挥发性风味物质的阈值。

1.3 数据处理

采用Excel 2019进行数据处理，SIMCA14.1、OriginPro2019b绘图。

2 结果与分析

2.1 不同腌制时间对大河乌猪火腿挥发性成分的影响

不同腌制时间下的大河乌猪火腿的挥发性风味物质鉴定结果如表1所示；腌制时间对挥发性风味物质的种类及相对含量的影响如表2所示。

从表1~表2可见：4个不同腌制期的挥发性物质种类与含量均存在差异。共鉴定出77种挥发性化合物，包括醛类15种、醇类13种、烃类10种、酮类4种、酯类5种、酸类8种、芳香族化合物9种、其他13种；且腌制15、18、21、24 d的挥发性成分的种类分别为57、57、54、41种。不同腌制时间的大河乌猪火腿共有的挥发性风味物质包括醛类（异戊醛、己醛等）；醇类（乙醇、正己醇等）；酮类（2,3-辛二酮等）；酸类（丁酸、异戊酸、己酸等）。醛类和醇类在每个腌制期中二者含量之和超过挥发性风味成分总量的一半。此外，有些物质随着腌制时间的延长而消失，例如反-2-辛烯醛、肉豆蔻醛、1-戊醇等。

表 1 不同腌制时间的大河乌猪火腿挥发性风味物质Table 1 Volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

表 2 腌制时间对挥发性风味物质的种类及相对含量的影响Table 2 Effects of curing time on the types and relative content of volatile flavor substances

续表 1

在4个腌制期中，检测到醛类物质的相对含量最多，此结果与Sabio等[23]在研究巴约讷、伊比利亚火腿时得出的结果一致。己醛、壬醛是大河乌猪火腿中含量最丰富的醛类，研究结果与伊斯特拉火腿的典型特征风味物质相似[24]。此外，醛类化合物含量随着腌制期的延长没有规律性，分别为52.08%、40.84%、64.26%、34.91%，推测由于醛类物质化学性质活泼，在腌制过程中受温度、时间等影响，导致其相对含量变化。醇类化合物主要来自脂质氧化、氨基酸降解[25]。醇类化合物的相对含量随着腌制时间而增加，可能是腌制过程中食盐的生物渗透作用能够加速酯类氧化，NaCl破坏细胞膜的完整性，促使氧化剂进入脂质基质来促进脂质氧化[26]。本研究共鉴定出13种醇，含量最丰富的是1-辛烯-3-醇，与Radovčić等[27]的报道一致，其已被鉴定为金华火腿、如皋火腿、盘县火腿的特征风味[28−29]。来自于脂肪酸烷氧自由基均裂的烃类物质[29]阈值较高。随腌制时间的延长，烃类物质的种类几乎保持不变，当腌制期为21 d时，其相对含量最低，为2.24%，其相对含量突然骤降是由于1,1,3,3-四乙氧基丙烷在其余3个腌制期中含量较高但在此阶段未检出。

酮类化合物来源于微生物代谢、脂肪氧化，具有奶油味、果香味[30]。在大河乌猪火腿中，酮类物质含量较低，且2-壬酮为主要酮类物质。由酸和醇经酯化作用而成的酯类大多具有果香味。本研究中，随腌制时间的延长，酯类化合物相对含量呈先增加后降低的趋势，推测原因可能是在腌制15、18、21 d时，生成的酯类含量大于酯类氧化消耗的，而腌制24 d时，酯类氧化的速度加快，所消耗的量增多。酸类化合物来源于甘油和磷酸的氧化降解、美拉德反应[31]。在4个腌制期均检测到了丁酸、异戊酸、己酸、辛酸、癸酸。随腌制时间的增加，酸类物质的相对含量呈现先增加后降低的趋势，且在18 d达最大值，为5.68%。可能由于腌制时间低于18 d时，原料表面的微生物作用产酸使火腿中的酸类物质增加，而随着腌制时间的延长，火腿中的食盐浓度达到一定程度，从而发挥防腐作用，抑制微生物的生长[32]。苯类物质具有较高的阈值，对火腿风味贡献较小。不同腌制时间下加工的大河乌猪火腿分别检测出7、6、2、5种芳香族类风味物质，苯乙烯和4-甲基苯酚是4个腌制期均存在的风味物质。

在其他类中，鉴定出多种杂环类化合物、吡嗪类等。杂环类化合物由于通过硫胺素的降解、氨基酸的热解形成，多数具有肉香。其次，吡嗪类化合物赋予肉品坚果及烘烤香味[33]。在大河乌猪火腿中，检测到的吡嗪类物质有2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。在盘县火腿、金华火腿中均鉴定出多种杂环类化合物、吡嗪类物质[28−29]。

2.2 挥发性化合物聚类分析（HCA）

为进一步观察4个腌制期的火腿样品组间和组内的相似程度与差异，采用SIMCA14.1绘制聚类图，以77种风味物质含量为变量，其聚类分析结果显示（图1），由图（样品编号1~4、5~8、9~12、13~16分别表示腌制15、18、21、24 d的火腿样品）4个不同腌制时间的大河乌猪火腿样品被聚为2大类（腌制15、18 d和腌制21、24 d聚在一起）和4个小类（1~4、5~8、9~12、13~16聚在一起），说明4个不同腌制时间的火腿样品具有明显差异，即挥发性物质的组成及相对含量存在较大的差异。故利用聚图能很好地区分不同腌制时间大河乌猪火腿的挥发性风味。

图 1 不同腌制时间下大河乌猪火腿的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of Dahe black pig ham under different curing time

2.3 ROAV鉴定不同腌制时间的关键性风味物质

结合各风味物质的感觉阈值，计算ROAV值，进一步确定大河乌猪火腿的关键性风味物质。通过相关文献共找到38种挥发性物质的气味阈值（见表1）[21−22]。因此，本实验只对查询到阈值的风味物质做出分析。当0.1≤ROAV<1时，该挥发性物质对火腿的总体风味起辅助作用；ROAV≥1时，该挥发性物质为火腿的关键风味物质；在不同腌制时间大河乌猪火腿的挥发性风味物质中（表1），壬醛的相对含量较高，且阈值只有1 μg/kg，故对风味贡献较大。以壬醛作为基准物来计算其他挥发性化合物的ROAV，则壬醛的ROAV为100。对各相关组分的ROAV分析结果如表3。

由表3可知，4个不同腌制时间的大河乌猪火腿中，ROAV≥0.1的共有11种醛类、3种醇类、2种烃类、2种酮类、2种芳香族化合物、1种呋喃类。腌制15、18、21、24 d火腿的关键性风味物质（ROAV≥1）分别为11、10、10、9种。异戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮是4个不同腌制时期的关键性风味物质；其中，醛类为主要的关键风味物质，醛类主要呈坚果味、油脂味、青草味且多数醛类物质对火腿风味起积极贡献的作用[33]。其次，对大河乌猪火腿有重要修饰作用的风味物质分别为苯甲醛、2-正戊基呋喃。当腌制期18 d时，己醛的ROAV值是4个腌制期中最低的，为21.85。已醛呈强烈的生油脂味，含量过多则会使人发呕。由此可见，大河乌猪火腿风味形成与腌制密切相关。

表 3 不同腌制时间下大河乌猪火腿关键性风味物质及对应的ROAVTable 3 Key flavor compounds of Dahe black pig ham and corresponding ROAV under different curing time

2.4 关键挥发性化合物的PCA

为进一步研究4个腌制期对大河乌猪干腌火腿挥发性风味物质的影响，选取14种对大河乌猪干腌火腿挥发性风味有贡献（ROAV≥1）的化合物进行PCA，得分图和载荷图分别如图2所示。

由图2可知，4个腌制时间的PC1贡献的方差为55.83%，PC2贡献的方差为27.84%，前两个主成分的累积方差贡献率为83.67%，能较好地反映原始数据的绝大部分信息。其中，PC1中载荷正向最高的物质为1-辛烯-3-醇，载荷负向最高的物质为异戊醛；PC2中载荷正向最高的物质为正辛醛，载荷负向最高的物质为双戊烯。上述结果说明1-辛烯-3-醇、异戊醛、正辛醛、双戊烯是不同腌制期火腿中含量变化最明显的挥发性物质，因此，可以根据上述物质区分不同腌制时间的大河乌猪火腿。

不同腌制时间的大河乌猪火腿总体可分为4类，腌制15、18、21、24 d的样品各自聚为一类且具有较明显的分离趋势，说明这4个腌制期关键中风味物质含量和种类存在较大差异，与聚类（图1）结果一致，表明腌制时间对大河乌猪火腿的挥发性风味物质有一定影响。

图 2 不同腌制时间下大河乌猪火腿关键挥发性化合物主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of key volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

3 结论

腌制时间影响大河乌猪火腿挥发性风味物质的形成，腌制15、18、21、24 d的挥发性成分的种类分别为57、57、54、41种，共鉴定出醛类、醇类、烃类等挥发性化合物共77种，醛类物质相对含量最多；聚类分析表明4个不同腌制时间的火腿样品具有明显差异，即挥发性物质的组成及相对含量存在较大的差异；ROAV分析表明腌制15、18、21、24 d的关键挥发性化合物（ROAV≥1）的种类分别为11、10、10、9种；异戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮为关键挥发性化合物；PCA表明1-辛烯-3-醇、异戊醛、正辛醛、双戊烯是不同腌制期火腿中相对含量变化最明显的挥发性物质。本研究结果可为大河乌猪火腿工艺技术的优化和风味品质的改良提供理论依据。