苯酚-硫酸法测定酒蒸多花黄精多糖含量的优化

王迎香，唐子惟，彭 腾，陈胡兰，高天宇，何沛煜，张军银

（成都中医药大学药学院，四川成都 611137）

黄精，传统补益药，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾功能。明代缪希雍撰写的药学著作《本草经疏》中曾记载：“虽非治疗之所急，而为养性之上药。故仙经累赞其能服饵驻颜，久而弥胜矣”。黄精因性平、无毒，在2002年被收录在药食同源目录中，一直延续至今。经过现代药理学研究证明，黄精多糖能够抑制肿瘤，提高动物免疫调节作用，对糖尿病模型有显著作用[1−5]。黄精水煎液提取物对体外皮肤紫外线实验中表现出抗衰老作用[6]，提示在人体保健方面具有延缓衰老功效。此外，基于网络药理学[7]对黄精有效成分进行预测，黄精可用于抗疲劳。有研究对保健食品进行调查统计，发现中药类保健品占据较大的市场份额。其中以增强免疫力功能的保健食品占额最多，黄精的添加使用频率高达中药类原料排名前20[8−9]。现已有黄精代泡茶、黄精粉等产品用于食品营养。黄精中主要活性成分为多糖类，多糖含量的测定是黄精质量标准研究的重要考察项目。因此，准确测量黄精的多糖含量对保健食品的应用开发具有深远意义。

植物多糖为天然高分子化合物，因其复杂的分子结构而具有广泛的活性作用[10−11]，添加于保健食品的多糖对肠道调节有积极影响[12−14]。测定多糖的方法涵括比色法、高效液相色谱法、气相色谱法等，其中比色法因操作方便而被广泛采用。有学者[15−16]探究比色法测定原理，比色法通常利用浓硫酸与多糖样品混合进行短时间的水解反应，生成寡糖和单糖，再与显色剂进行显色反应，在紫外分光光度计下进行吸光度测定。此过程中，浓硫酸水解的完全、显色剂的选择等条件对多糖的测量都表现出影响。在测量黄精多糖时蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法使用频率最高。

两种方法原理相似，但反应条件不同，显色剂不同，二者用于测量其他药材多糖含量时存在差异[17]。蒽酮-硫酸法测定黄精多糖收录于2020年药典一部，但该方法稳定性需要控制好测定条件，如蒽酮结构不稳定需现用现配、注意避光等问题[18]。本课题组前期多次重复实验发现显色前配制蒽酮时间过早，对测定吸光度影响较大，管控配制时间过于繁琐。有现代大量研究发现采用苯酚-硫酸法测定黄精多糖操作简单、稳定性好[19−20]。苯酚-硫酸法测定多糖技术虽较为成熟，但在采用苯酚-硫酸法测定黄精多糖时存在所用苯酚浓度、硫酸用量、显色时间等条件不统一的问题，如用过多的浓硫酸会糖碳化从而影响吸光度[21]。目前2020版中国药典中测量黄精多糖并未规范此方法，为建立更合适的苯酚-硫酸测量黄精多糖的方法，本研究选取苯酚浓度、苯酚用量、硫酸用量、加热时间、加热温度五个因素进行单因素考察。在此基础上对苯酚-硫酸法的测定条件进行响应面优化，建立适宜酒蒸黄精多糖测量的最优显色条件，旨在为未来中国药典制定酒黄精质量标准提供有力研究基础，为该药材资源的合理开发及质量控制提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄精药材 采于四川省达州市大竹县，经成都中医药大学生药学教研室龙飞副教授鉴定为百合科多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根茎；D-葡萄糖对照品 四川维克奇生物有限公司；黄酒 绍兴舜丰酿酒有限公司；98%浓硫酸 四川西陇科学有限公司；苯酚 成都市科隆化学品有限公司；蒽酮 成都市科隆化学品有限公司。

紫外分光光度计SPECORD 200 plus 德国耶拿分析仪器股份公司；手提式中药粉碎机 温岭林大机械有限公司；电蒸锅 广东山姆斯电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酒蒸黄精多糖溶液制备 参照2020年药典一部方法。

1.2.1.1 酒蒸黄精制备 取净黄精，照酒蒸法（通则0213）。每100 kg黄精，用黄酒20 kg拌匀，于300 W电蒸锅上蒸制6 h，晾至室温，切4 mm厚片，干燥。得到酒蒸黄精饮片，打粉，过5号筛，备用。

1.2.1.2 多糖溶液制备 精密称定酒黄精细粉0.25 g，加80%乙醇150 mL，水浴加热回流1 h，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，弃去滤液。将残渣和滤纸置于烧瓶中，加水150 mL，沸水浴中加热回流1 h，趁热过滤，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液，放冷，转移至250 mL容量瓶中，定容，备用。

1.2.2 蒽酮-硫酸法测定多糖

1.2.2.1 标准曲线绘制 配制好葡萄糖标准溶液与蒽酮-硫酸溶液后，参照2020年药典一部中测量黄精多糖时标准曲线的制作方法绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品多糖含量测定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.2.3”项进行显色。带入标准曲线，计算样品含量。

1.2.3 苯酚-硫酸法测定多糖 参照本课题组已有研究基础[22]测量黄精多糖含量。

1.2.3.1 标准曲线绘制 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖标准溶液于10 mL具塞试管中，加蒸馏水至2 mL刻度线，摇匀，试管置于冰水浴中。试管中加入1 mL苯酚溶液，摇匀后尽快加入7 mL的浓硫酸溶液，摇匀。放冷后于40 ℃水浴中保温30 min，取出放入冰水水浴5 min，取出后恢复至室温。以相应显色试剂作为空白组，于490 nm波长下测定吸光度，计算回归方程。

1.2.3.2 样品多糖含量测定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.3.3”项进行显色。带入标准曲线，计算样品含量。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度考察试验 分别移取“1.2.1”项下黄精多糖溶液1.0 mL于具塞试管中，按照蒽酮-硫酸法进行显色，以蒸馏水为参比，在紫外分光光度计特定波长下连续测定吸光度5次，计算RSD值，考察精密度。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.2 重现性考察试验 分别移取5份“1.2.1”项下黄精多糖溶液1.0 mL于具塞试管中，按照蒽酮-硫酸法进行显色，以蒸馏水为参比，在紫外分光光度计特定波长下测定吸光度，计算RSD值，考察重现性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.3 稳定性考察试验 分别移取“1.2.1”项下黄精多糖溶液1.0 mL于具塞试管中，按照蒽酮-硫酸法进行显色，以蒸馏水为参比，在紫外分光光度计特定波长下进行时间-吸光度曲线的扫描，考察稳定性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.4 加样回收率考察试验 精密量取5份已测含量的黄精多糖溶液，分别加入已知含量的葡萄糖标准溶液，按照蒽酮-硫酸法进行显色，以相应空白组为参比，在紫外分光光度计特定波长下测定吸光度，计算回收率。苯酚-硫酸法同上。

1.2.5 苯酚-硫酸法工艺优化 选择苯酚-硫酸法进行深入工艺优化实验。

1.2.5.1 单因素实验 根据已有研究[23−25]选定五个单因素条件进行试验。按照“1.2.3”项苯酚-硫酸法显色条件，进行单因素对吸光度的影响考察。在固定苯酚用量1.0 mL、苯酚浓度5%、硫酸用量7 mL、加热温度50 ℃、加热时间20 min的条件下，每个因素设置5个水平：苯酚用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）、加热时间（10、15、20、25、30 min）、加热温度（40、50、60、70、80 ℃）、苯酚浓度（3%、4%、5%、6%、7%）、硫酸用量（5、6、7、8、9 mL）。

1.2.5.2 响应面试验设计 根据单因素的实验结果，选取苯酚用量（A）、苯酚浓度（B）、硫酸用量（C）3个因素为自变量，结合Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken分析，设计响应面试验对苯酚-硫酸法测定黄精多糖含量条件进行优化，设计因素见表1。

表 1 Box-Behnken试验设计Table 1 Box-Behnken experimental designs

1.3 数据处理

每组试验重复3次，试验结果以均值±标准差表示。单因素实验结果用SPSS23.0进行显著性筛选，响应面试验结果用Design-Expert 8.0.6进行数据分析，用Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 最大波长的确定

两种方法显色后，以相应试剂为空白，于分光光度计上进行波长扫描，见图1~图2。在400~800 nm的可见光范围内，苯酚-硫酸法最大吸收波长为489 nm，但多次扫描过程中波峰出现平峰，集中在488~491 nm区间，为规范化操作故参照文献中苯酚-硫酸测定方法取490 nm进行试验。蒽酮-硫酸法最大吸收波长为580 nm，参照中国药典中蒽酮-硫酸测定方法取582 nm进行试验。

图 1 蒽酮-硫酸法波长扫描Fig.1 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

图 2 苯酚-硫酸法波长扫描Fig.2 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

2.2 线性关系考察

2.2.1 蒽酮-硫酸法 按“1.2.2.3”项进行显色，以葡萄糖浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图3所示。拟合得到线性回归方程y=0.0269x+0.0739，R2=0.9991。表明该线性方程在葡萄糖浓度3.3~26.4 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

图 3 蒽酮-硫酸法标准曲线Fig.3 Standard curve of anthrone sulfuric acid method

2.2.2 苯酚-硫酸法 按“1.3.3.3”项进行显色，以葡萄糖浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图4所示。拟合得到线性回归方程y=0.0689x−0.0225，R2=0.9992。表明该线性方程在葡萄糖浓度3.5~14 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

图 4 苯酚-硫酸法标准曲线Fig.4 Standard curve of phenol sulfuric acid method

2.3 精密度试验结果

分别采用两种方法对黄精多糖进行显色反应，连续测量吸光度值5次，测得吸光度分析结果见表2。

表2 显示，连续测定5次吸光度后，苯酚-硫酸法的RSD=0.01%，蒽酮-硫酸法的RSD=0.20%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法精密度高。

2.4 重现性测试结果

分别采用两种方法对5份黄精多糖进行显色反应，测定吸光度值，测得吸光度分析结果见表3。

表3 显示，对5份黄精多糖溶液进行吸光度测定后，苯酚-硫酸法的RSD=1.73%，蒽酮-硫酸法的RSD=1.84%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法重现性好。

2.5 稳定性测试结果

采用两种方法分别对黄精多糖溶液进行显色，在紫外分光光度计上进行时间扫描，扫描时间为120 min，扫描结果如图5。

图 5 时间扫描曲线Fig.5 Time scan curve

图5 时间扫描显示，显色后吸光度在120 min内波动较小，说明两种方法显色的黄精多糖吸收曲线受环境温度和时间的影响变化不大，在120 min内保持稳定。二者相比之下，苯酚-硫酸法波动较蒽酮-硫酸法更加微小，稳定性好。

2.6 加样回收率测试结果

精密称取已知多糖含量的黄精粉末，分为两组平行实验。加入精密称定的葡萄糖对照品，设置五水平，平行重复三次。分别采用两种显色方法进行吸光度测量，计算平均回收率，测试结果如表4。

表4 显示，蒽酮-硫酸法平均回收率低于苯酚-硫酸法。蒽酮-硫酸法的RSD=1.38%，远高于苯酚-硫酸法，表明苯酚-硫酸法所测结果相对更加稳定，苯酚-硫酸法用于多糖显色更加可行。

综合方法学考察结果，蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法各项RSD都在规定范围内，两种方法可靠、可行。二者RSD结果对比来看，苯酚-硫酸法每一项都低于蒽酮-硫酸法，表明用苯酚-硫酸法测定多糖含量更精确度高、重现性好、稳定性好、加样回收率高。综合实际操作性，苯酚-硫酸法加热温度和时间都低于蒽酮-硫酸法，处理样品时更加方便快捷。因此，下一步将进行苯酚-硫酸法显色条件优化。

表 2 精密度测试结果Table 2 Precision test results

表 3 重现性测试结果Table 3 Reproducibility test results

表 4 回收率试验结果Table 4 Recovery test results

2.7 多糖含量测定

用两种方法对样品进行含量测定，以相应的显色试剂为空白组，带入线性方程计算结果，蒽酮-硫酸法测得含量为8.01%，苯酚-硫酸法测得含量为7.89%。

2.8 单因素实验结果

2.8.1 苯酚用量对吸光度影响 不同苯酚用量对吸光度的影响见图6。加入5%浓度苯酚，用量从0.5 mL增加到1.5 mL时，溶液吸光度迅速升高，且达到极值。继续增大苯酚用量，达到1.5 mL后吸光度趋于平缓，后有下降趋势。这与参考文献[21]得到的结果一致，推测在低用量时吸光度与反应底物呈正相关，苯酚用量达到饱和后吸光度不再增加。后呈现减小的趋势，推测是多糖与浓硫酸反应的同时过多的苯酚与浓硫酸产生磺基化反应[26]，导致多糖未完全脱水形成糖醛衍生物与苯酚结合显色。虽然苯酚与浓硫酸反应生成物含有显色团，但相比于糖与苯酚的结合显色，整体表现为吸光度减少的趋势。故苯酚用量选1.5 mL适宜。

图 6 苯酚用量对吸光度的影响Fig.6 Effect of phenol dosage on absorbance

2.8.2 苯酚浓度对吸光度影响 不同苯酚浓度对吸光度的影响见图7。加入1 mL苯酚，吸光度与苯酚浓度整体成正比关系。在浓度为5%时吸光度达到增长率最大，加大苯酚浓度，增长趋于平缓且有下降趋势。推测同“2.8.1”项下，苯酚浓度达到一定程度后显色反应饱和，过多的苯酚影响了多糖与浓硫酸的反应导致吸光度下降。故苯酚浓度选择5%合适。

2.8.3 硫酸用量对吸光度影响 不同硫酸用量对吸光度的影响见图8。在低用量范围内，吸光度与硫酸用量整体呈现正趋势相关。在7 mL时吸光度达到最大值，后增长缓慢且有下降趋势。推测是因为7 mL时反应达到饱和，再增大用量，多余的浓硫酸使糖碳化，影响显色效果[21]。故硫酸用量为7 mL合适。

图 7 苯酚浓度对吸光度的影响Fig.7 Effect of phenol concentration on absorbance

图 8 硫酸用量对吸光度的影响Fig.8 Effect of sulfuric acid dosage on absorbance

2.8.4 加热温度、加热时间对吸光度影响 不同加热温度、加热时间对吸光度影响见图9~图10。考察结果利用SPSS软件进行单因素分析，发现这二者因素的数据并不具有显著差异性（P˃0.05），提示加热温度、加热时间对吸光度的影响甚微。推测是因为苯酚-浓硫酸显色反应原理是样品中的多糖在浓硫酸作用下脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚进行缩合反应，此显色反应本身为放热反应，放出大量热量，外界温度对反应影响较小[17]。故二者对吸光度影响并不明显。在进行苯酚-硫酸法测量多糖工艺优化时可忽略加热温度、加热时间二者影响。

图 9 加热温度对吸光度的影响Fig.9 Effect of heating temperature on absorbance

图 10 加热时间对吸光度的影响Fig.10 Effect of heating time on absorbance

2.9 响应面优化试验结果与分析

2.9.1 响应面优化试验结果 根据“2.8”项下单因素的实验结果，选取苯酚用量（A）、苯酚浓度（B）、硫酸用量（C）3个因素为自变量进行条件优化。结合Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken分析，设计了17个试验点的响应面试验方案，试验结果如表5。

表 5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and results of response surface test

2.9.2 模型拟合与方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对“2.9.1”项下试验数据进行拟合，并建立二次多元回归方程：

回归方程分析结果如表6。模型的F=66.69，P<0.0001，表明试验选择的二次模型具有显著性，且失拟项P=0.1153，不显著，模型与实际非正常误差所占比例较小，说明模型拟合良好，能够较准确反映吸光度与苯酚用量、苯酚浓度、硫酸用量之间的关系。回归方程的确定系数R2=0.9885，表明此模型能够反映97.37%的吸光度变化；校正确定系数R2adj=0.9737，二者都大于0.9，接近于1，表明此模型与实际的实验结果拟合效果好，作吸光度的预测可靠。变异系数C.V.=4.16<5，变异系数越小，表明偏离程度越小，该模型精确度高。分析各项P值表现的显著性，因素C、C2的P值呈现高度显著性（P<0.001），对实验结果影响高度显著（P<0.001）；因素B、A2、B2也有极显著影响（P<0.01）；因素A、AB、BC也有显著影响（P<0.05）。通过比较F值大小可知，在选定水平范围内各因素对吸光度的影响大小为：硫酸用量>苯酚浓度>苯酚用量。

表 6 方差分析和显著性差异结果Table 6 Analysis of variance and significant difference results

2.9.3 等高线图及响应面图分析 采用Design-Expert 8.0.6软件绘制等高线图及响应面图，结果见图11。通过等高线图和响应面图能够直观反映各因素之间的交互影响。等高线为平面图，愈趋近于椭圆形则表明交互作用对响应值的影响显著，反之，圆形则不显著。响应面为立体图，坡度愈陡，交互作用影响显著，反之，平缓则不显著。结合各因素的等高线图与响应面图可见，因素B与C，即苯酚浓度、硫酸用量二者交互作用最明显，其次是因素A与B，即苯酚用量与苯酚浓度。

图 11 各因素交互作用影响的等高线图及响应面图Fig.11 Contour map and response surface map of interaction of various factors

根据上述结果，结合模拟方程进行优化，得到的预测最优条件为：苯酚用量1.54 mL、苯酚浓度4.42%、硫酸用量6.49 mL，预测吸光度为0.7455，结合实际操作的可行性，调整实际参数为苯酚用量1.5 mL、苯酚浓度4.5%、硫酸用量6.5 mL。

2.9.4 工艺验证 按“2.9.3”项下确定的实际可行的最优工艺进行验证实验，当测量条件苯酚用量1.5 mL、苯酚浓度4.5%、硫酸用量6.5 mL时测定吸光度为0.7327，接近预测值，该最优工艺稳定可靠。酒黄精样品多糖平均含量8.50%，RSD=0.87%。

3 结论与讨论

本实验选取了五因素五水平进行单因素实验，其中苯酚用量、苯酚浓度、硫酸用量表现出显著差异性（P<0.05），而加热温度、加热时间的实验结果不具有统计学意义，因此选取苯酚用量、苯酚浓度、硫酸用量进行响应面分析实验。各因素对吸光度的影响大小为：硫酸用量>苯酚浓度>苯酚用量。优化后的最佳显色条件是苯酚用量1.5 mL、苯酚浓度4.5%、硫酸用量6.5 mL。对酒黄精多糖进行测定，平均含量为8.50%，相对标准偏差为0.87%。

本实验选取了多糖含量测定常用的两种方法进行测定。在线性关系、精确度、重现性、稳定性、加样回收率的考察结果中，蒽酮-硫酸法及苯酚-硫酸法二者均能可靠、有效测定酒黄精中的多糖含量。但蒽酮-硫酸法需提前配制，保存不便易变质，在稳定性试验中明显低于苯酚-硫酸法。此外，两种方法对同一样品测量结果存在差异，苯酚-硫酸法低于蒽酮硫酸法，与课题组前期研究[22]结果一致。孙晓燕等[27]研究发现，苯酚-硫酸法受酒蒸黄精中所含蛋白质影响较小，测量更加灵敏，酒黄精多糖含量更加准确。苯酚-硫酸法所要求的反应条件较为简单，操作简单快捷。但是在苯酚-硫酸法的操作过程中发现苯酚长期暴露在空气中易氧化，加入试管后浓硫酸应尽快加入，以免造成人为误差。蒽酮-硫酸法易受蛋白质等物质影响，按照药典中黄精多糖的提取方法进行提取，发现蛋白质未完全除净，对蒽酮法测量多糖存在较大干扰。现常用Sevage法、酶法、三氯乙酸法进行黄精多糖的纯化[28−30]，故认为药典中所收录的黄精多糖溶液提取方法还需进一步考虑蛋白质对测量结果的影响，更新优化提取方法。

本实验建立了适宜酒蒸黄精多糖的最优苯酚-硫酸测量工艺，填补了目前酒黄精研究领域中的空缺，为后期全面深入研究黄精九蒸九晒炮制品、生品中多糖含量的测量提供了科学依据；为未来中国药典制定酒黄精质量标准提供了有力的研究基础；为黄精药食同源产品的开发提供了参考价值。