通过型固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中23种磺胺类药物残留

杨 坤，刘桂琼，管春成，陈光静

（1.黔东南州食品药品检验检测中心，贵州凯里 556012；2.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳 550005）

磺胺类药物（sulfonamides，sAs）是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺结构的抗生素[1−3]，能够抑制细菌的生长繁殖，具有较强的抗菌作用，因其优异的抗菌谱广、价廉、使用方便而广泛用于畜牧生产。但磺胺类药物的不合理使用，可通过肉类食品在人体内蓄积而给人体造成各种潜在危害[4−6]，且磺胺类药物存在严重副作用和潜在的致癌性，其耐药性问题也日益严重。因此，我国以及欧盟、美国等大多数国家对食品中磺胺类药物的最高残留量均有明确规定，如我国规定所有食用动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中磺胺类药物的最大残留量为0.1 mg/kg[7]。

磺胺类药物残留问题越来越受社会的关注，其检测方法主要有酶联免疫法[8]、液相色谱法[9−10]、液相色谱-串联质谱法[11−17]等。酶联免疫法属于半定量筛查法，容易出现假阳性现象。液相色谱法灵敏度低，抗干扰能力弱，定性效果差。液相色谱-串联质谱法具有液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度和准确度，但存在分析时间较长。超高效液相-串联质谱法可在较短时间内分析目标化合物，正逐渐成为兽药残留分析的有效手段。

磺胺类药物残留的前处理主要有液液萃取[18−19]、固相萃取[20−23]、基质固相分散萃取[24−25]等方法，这些方法存在有机溶剂消耗量较大，操作复杂，检测成本高等问题。PRiME HLB采用通过型的新型固相萃取柱，无需活化与平衡，只需上样、淋洗和洗脱3个步骤即可完成样品净化过程，可将净化速度提高40%[26]。目前国内外对PRiME HLB前处理的研究报道，主要为孙晓冬等[27]测定了液态乳中14种真菌毒素；方灵等[28]测定了牛奶中38种抗生素；郝杰等[29]仅研究14种磺胺类药物残留等。而通过型固相萃取净化技术，应用于检测鸡肉中多种磺胺类药物残留的研究尚未报道。本研究采用PRiME HLB前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立测定鸡肉中23种磺胺类药物的测定方法。该方法简便快速，易于操作，可为鸡肉中多种磺胺类药物残留提供快速检测方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇和乙腈 色谱级，德国Merck公司；甲酸色谱纯，天津科密欧化学试剂；固相萃取小柱：Oasis PRiME HLB（60 mg，3 mL） 美国Waters公司；试验用水为超纯水；16批鸡肉样品 购于农贸市场；23种磺胺标准品（磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺索嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯） 纯度均≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer公司。

Agilent 1290 Infinity II型液相色谱仪 配二元高压泵、自动进样器和柱温箱，美国Agilent公司；AB SCIEX API 4000+质谱联用系统 配电喷雾离子源（ESI）及Analyst1.6.3数据处理软件，美国AB SCIEX公司；Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Acquity UPLC CSH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、手动固相萃取装置 美国Waters公司；Milli-Q纯水机 美国Millipore公司；MS205DU电子天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）仪器公司；3-18k型高速冷冻离心机德国Sigma公司；E.T平行氮吹浓缩仪 北京莱伯泰科仪器公司；KQ-700DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理方法 称取2.5 g（精确至0.01 g）鸡肉样品至50 mL聚丙烯离心管中，加入80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10 mL，涡旋振荡10 min，8000 r/min冷冻离心10 min，转移上清液于20 mL容量瓶中，重复提取一次，合并上清液，用提取液定容至刻度，待净化。

取Oasis PRiME HLB固相萃取柱，无需活化与平衡，用移液管吸取5.0 mL提取液上固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，再用2 mL 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）冲洗，收集并合并流出液，40 ℃氮吹干，用10%的甲醇溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.0 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液上机分析。

1.2.2 标准溶液的配制 称取10 mg（精确至0.1 mg）各标准物质，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度均为1.00 mg/mL的单标储备液；吸取各单标储备液1.0 mL至同一100 mL容量瓶中，以甲醇定容并混匀，配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准工作溶液，于−18 ℃下密闭保存。

1.2.3 基质匹配标准溶液配制 按1.2.3操作获得空白样品净化溶液。分别移取6份空白样品净化溶液1.0 mL于10 mL离心管中，分别加入质量浓度为20 ng/mL混合标准溶液10、20、50、100、200、1000 μL，氮吹至近干，用10%（体积分数，下同）的甲醇水溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.00 mL，配制成质量浓度分别为0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、20.00 ng/mL的基质匹配标准溶液系列（该溶液现配现用），经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液用于上机分析。

1.2.4 色谱条件 Waters Acquity UPLC CSH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；进样体积5 μL；流速0.25 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0~1.00 min，10%B；1.00~3.00 min，10%~20% B；3.00~7.00 min，20%~25% B；7.00~7.50 min，25%~60% B；7.50~9.00 min，60%~90% B；9.00~9.10 min，90%~10% B；9.10~12.00 min，10% B。

1.2.5 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）：正离子电离模式；去溶剂温度：550 ℃；气帘气压力：172 kPa；碰撞气压力：41 kPa；离子气1压力：414 kPa；离子气2压力：379 kPa；喷雾电压：5500 V；扫描方式：依赖保留时间的多反应监测（scheduled MRM），其他质谱参数条件见表1。

1.3 数据处理

方法重复性及回收率试验均做6次重复试验，采用Excel2016进行数据整理、分析，仪器数据采集软件为Analyst1.6.3，数据分析软件为MultiQuant2.1。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 提取溶剂的优化 磺胺类药物分析常用的提取溶剂为乙酸乙酯[19]、乙腈[4,25,28]、乙腈水溶液[17,26]等。乙腈为提取液为中等极性溶剂与磺胺类药物的极性接近，能使蛋白质变性沉淀且相对于乙酸乙酯不易提取出磷酯类等杂质，因此，选择乙腈作为提取溶剂，并分别考察90%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和60%乙腈水溶液4种提取溶液对目标化合物提取效果，结果见图1。结果表明，80%乙腈水溶液作为提取液时23种磺胺类药物的回收率较高，分析原因是60%乙腈水溶液和70%乙腈水溶液提取后的提取液较混浊，基质效应大，90%乙腈水溶液提取液虽较澄清，但90%乙腈水溶液过固相萃取柱时由于乙腈比例过高导致蛋白质快速凝结成团，从而阻止提取液进入萃取柱内部发生作用，这印证龚兰[30]等在鸡肉样品中用80%乙腈水溶液提取6种磺胺类药物回收率高。

由于磺胺类药物化合物的分子结构中含有氨基和磺酰胺基，具有酸碱两性，在提取液中加入一定比例的酸或碱提取可显著提高回收率。考察了80%乙腈水、80%乙腈水（含0.2%甲酸）和80%乙腈水（含0.2%氨水）3种提取溶液对回收率的影响，结果见图1。结果表明，酸性提取剂可获得更优的回收率。因此，最终确定提取溶剂为80%乙腈水（含0.2%甲酸）。

图 1 不同提取剂对磺胺药物的平均回收率比较Fig.1 Comparison of average recovery rates of sulfonamides by different extracters

2.1.2 净化条件的优化 本实验采用PRiME HLB固相萃取柱对样品进行净化，因此，需要考察Oasis PRiME HLB（200 mg，6 mL）的柱容量，比较了不同上样体积的样品净化程度。结果表明，上样液中体积≤5 mL时，基质效应小，净化效果明显，而上样体积为5~10 mL时，基质效应逐渐增加，说明上样体积为5 mL时该柱对杂质的吸附能力接近饱和，过多的上样体积会造成部分杂质无法吸附，随目标化合物共流出，导致净化效果不理想。因此，本实验确定上样体积为5 mL。

表 1 23种磺胺类药物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 23 sulfonamides

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化 实验考察了Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC CSH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）对23种磺胺类药物的分离效果。发现Waters Acquity UPLC CSH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离效果好且有较高的灵敏度，质谱图见图2。因此，选择Waters Acquity UPLC CSH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为分离柱。

进一步对流动相的种类进行考察，当0.1%甲酸溶液作为水相选择乙腈作为有机相时，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺间甲氧嘧啶3种同分异构体分离效果较差，把乙腈更换为甲醇为有机相时，上述3种待测物的分离的较好，结果见图3，因此选择甲醇作为有机相。选择甲酸铵和乙酸铵作为水相时，磺胺硝苯和磺胺喹沙啉离子响应特别低，在水溶液中加入少量甲酸溶液作为流动相时能改善磺胺硝苯和磺胺喹沙啉的响应。因此，选择0.1%甲酸溶液和甲醇作为流动相。

图 2 混合标准溶液的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of mixed standard solution

图 3 3种磺胺的同分异构体色谱图Fig.3 Chromatograms of three sulfonamides

2.2.2 质谱条件优化 以流动注射方式在离子源正离子模式下对23种磺胺药物进行母离子（Q1）全扫描，确定目标化合物的母离子，再对母离子进行二级质谱扫描（MS2），对去蔟电压、碰撞能量等参数进行优化，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，优化后的质谱具体参数见表1。在优化后的色谱条件和质谱参数下，23种磺胺药物化合物的质谱图见图3，从图可知，23种磺胺类药物具有较好的分离度和灵敏度。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应评估 按“1.2.1”方法进行前处理，“1.2.2”方法配制鸡肉基质匹配标准溶液及纯溶剂标准溶液并作校准曲线，按基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率比值大小显示基质效应，斜率比越接近1，则基质效应越小[31−32]，结果见图4。从图可知，只有磺胺脒和磺胺硝苯基质效应抑制较大。因此，选择用空白基质匹配标准溶液曲线来校正基质效应对其定量的影响。

图 4 23种磺胺化合物在鸡肉中的基质效应图Fig.4 Matrix effect diagram of 23 sulfonamides in chicken

2.3.2 标准曲线、检出限和定量限 在优化的提取净化和UPLC-MS/MS分析条件下，23种化合物在鸡肉空白样品基质匹配标准溶液中的浓度与对应的峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.9996~0.9999，以定量离子3倍信噪比（S/N=3）得到检出限（LOD），以定量离子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限（LOQ），鸡肉样品的标准曲线和相关系数见表2。

2.3.3 实际样品的检测和加标回收率 采用本方法对农贸市场16批次鸡肉进行检测，均未检出目标化合物。在鸡肉空白样品基质中各添加质量浓度为1.0、2.0、5.0 μg/kg三水平的23种磺胺类药物的混合标准溶液测定回收率，每个添加水平重复测定6次，结果见表3。结果显示，3个添加水平下鸡肉样品中23种磺胺兽药的平均回收率为66.12%~99.83%，相对标准偏差为0.72%~10.36%。结果表明，该方法回收率较好，适用于鸡肉中23种磺胺类药物残留检测的方法要求。

表 2 23种磺胺类兽药在鸡肉样品中标准曲线、相关系数、检出限及定量限Table 2 Standard curve, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 23 sulfonamides in chicken samples

表 3 实际空白样品中23种磺胺类药物的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries rate and relative standard deviations of 23 sulfonamide drugs in real blank samples (n=6)

3 结论

本研究应用PRiME HLB前处理净化技术，以超高效液相色谱-四级杆质谱联用法建立了鸡肉中23种磺胺类药物残留的检测方法，通过对提取溶剂和净化条件的优化，样品经80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）提取，取5 mL提取液过固相萃取柱，在优化后的仪器条件下，23种磺胺类药物在线性范围0.2~20 ng/mL上具有良好的线性关系，检出限为0.1~2.0 μg/kg，定量限为0.25~5.0 μg/kg，在低、中、高3个加标水平下上平均回收率为66.12%~99.83%，RSD为0.72%~10.36%，本方法操作简单、灵敏度高，适用于鸡肉中多种磺胺类药物残留的检测。