陈山红心杉SCoT反应体系建立及引物筛选

娄永峰，宋晓琛，冷春晖，陈兴彬，朱新传，肖复明★

(1.江西省林业科学院·江西省植物生物技术重点实验室，江西 南昌330013；2.安福县陈山林场，江西 安福343214)

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国重要的乡土针叶用材树种，主要分布种植在长江以南各省区。由于广泛的种植区域和悠久的栽培历史，杉木形成了一些优良的变异类型，例如红心杉、罗田垂枝杉等，其中红心杉材质坚硬、色泽独特，历来受人们青睐。陈山红心杉是红心杉的典型代表，是江西地方特色杉木优良种源，原产于江西省安福县陈山林区，因其心材红褐色且心材比例大而得名。目前有关陈山红心杉的研究主要侧重在良种选育、种苗繁育等方面，其种质资源评价、遗传结构分析等的相关研究较少。随着陈山红心杉种质资源日益减少，对陈山红心杉种质资源的收集和保存工作就显得极为重要，但迄今为止仍对陈山红心杉种质资源的基因遗传结构等知之甚少，以至于无法实施针对性保护策略。近年来，DNA分子标记发展迅速，已广泛应用于杉木等林木种质资源遗传多样性分析、种质资源评价等方面，例如，Chen等通过ISSR标记分析了福建和台湾两地的杉木遗传多样性和变异[1]，Duan等利用SSR分子标记分析了南方6省700份杉木优树种质的遗传结构，并构建了核心种质[2]。

目标起始密码子多态性标记（Start codon targeted polymorphism,SCoT）是一种基于植物基因ATG起始密码子两侧的保守区域设计单引物并对基因组进行扩增，且扩增产物可用简便的琼脂糖凝胶电泳分离检测新型分子标记[3]，其具有适用性广、扩增位点多态性高、获得遗传信息丰富，同时操作简单方便等优点[4-5]，可用于物种的遗传多样性分析、种质资源的鉴定等方面，目前在五角枫（Acer mono）、柿（Diospyros kaki）、猕猴桃（Actinidia chinensis）、罗汉松（Podocarpus macrophyllus）等多种植物中应用[6-9]。

本研究以陈山红心杉为材料，建立并优化陈山红心杉SCoT-PCR的反应体系，筛选适合红心杉的最佳PCR反应体系，并进行引物筛选，为今后SCoT分子标记在陈山红心杉种质资源评价等研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试陈山红心杉种质材料均来自江西安福县陈山林区，在前期单株选优的工作基础上，采集优树新叶，于-80℃保存备用。

采用Collard和Mackill设计的SCoT分子标记引物SCoT-01～SCoT-36，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。即用型常规PCR预混合溶液2×Hieff PCR Master Mix（以下简称PCR Mix）、DL5000 DNA Marker、Agarose琼脂糖等购自翌圣生物科技（上海）有限公司。

1.2 基因组DNA提取和检测

利用改良的CTAB法提取陈山红心杉新叶DNA，同时琼脂糖凝胶电泳（0.8%）进行质量分析，用微量分光光度计（Eppendorf BioSpectrometer basic）检测其浓度，并将其定量至20.0 ng·μL-1，-20℃储存备用。

1.3 SCoT-PCR体系正交设计和PCR扩增

以SCoT-17为引物，陈山红心杉DNA为模板，对影响陈山红心杉SCoT-PCR反应体系的模板DNA、PCR Mix和引物浓度等3个因素进行优化，每个因素设置4个水平，采用L16（43）正交试验（表1）。按比例将各试剂加入PCR管，然后用ddH2O补足至20.0μL。PCR扩增程序为：95℃5 min的预变性；95℃30 s的变性，55℃1 min的退火，72℃2 min的延伸，35个循环；72℃10 min的总延伸，8℃保存。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离检测，并在凝胶成像系统中观察、拍摄以备后续分析。体系优化试验进行3次重复。

1.4 陈山红心杉SCoT-PCR体系的单因素优化

在正交试验结果的基础上，对模板DNA、PCR Mix和引物浓度等3个因素进行进一步的单因素优化，以确定陈山红心杉SCoT-PCR的最优体系。

1.5 陈山红心杉SCoT引物的筛选

根据体系优化的结果，在最优反应体系基础上，进行陈山红心杉SCoT引物筛选。首先随机选取1个陈山红心杉DNA对36条SCoT引物进行初筛，选择保留PCR扩增条带丰富、清晰的引物，然后随机选取4个陈山红心杉DNA对初筛获得的引物进行复筛，选择保留多态性较高的引物。

1.6 数据分析

正交试验采用直观分析法进行分析，先根据PCR扩增条带数量、清晰度等进行评分，然后通过评分结果，计算出各个因素在各个水平的平均值Ki和极差R。

2 结果和分析

2.1 陈山红心杉DNA质量分析

利用改良CTAB法，提取陈山红心杉基因组DNA，经检测其OD260/OD280值在1.8～2.0之间，0.8%琼脂糖凝胶电泳分析显示（图1），其主带清晰，没有明显弥散、拖尾现象。这说明DNA质量好，纯度高，可以用于后续分析。

图1 DNA电泳分析Fig.1 The result of DNA electrophoresis

2.2 陈山红心杉SCoT-PCR体系正交优化分析

如图2所示，在正交设计的16个组合中不同组合扩增得到的条带数量、条带清晰度等差异较大，其中，组合9、10和13等扩增较好，条带数量丰富，且清晰亮度高，而组合4、8和16等扩增条带数量较少，且条带清晰度较弱，效果不好。依据扩增条带的数量、亮度和清晰度等指标对3次重复分别进行评分，评分范围在1～16之间，16个组合的3次重复的平均分值依次为：5.7、5.3、5.0、3.7、11.7、7.0、10.3、3.3、15.7、16.0、5.3、3.7、15.7、12.0、9.0、2.3，其中组合10获得的分值最高，其PCR扩增获得的条带数量、亮度和清晰度等均最佳，其相应体系为：PCR Mix 10.0μL，模板DNA 3.0μL（60.0 ng），引物2.5μL（1.25μmol·L-1）。

直观分析结果表明（表1），3个因素对陈山红心杉SCoT-PCR的影响依次为PCR Mix＞引物浓度＞模板DNA。根据K值得出的最优反应体系为：PCR Mix 9.0μL，模板DNA 3.0μL（60.0 ng），引物2.5μL（1.25μmol·L-1），其与得分最高的组合10体系基本一致，仅PCR Mix用量上存在差异。

图2陈山红心杉SCoT-PCR体系正交优化试验Fig.2 The Orthogonal test results of Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR

2.3 陈山红心杉SCoT-PCR体系单因素优化分析

为了进一步优化反应体系，对模板DNA、PCR Mix和引物浓度这3个影响因素进行单因素分析。

模板DNA量是影响特异性扩增效率和扩增产物量的一个重要因子。结果表明（图3）：当模板DNA量为10.0 ng时，扩增条带数量少，同时条带亮度较低，当模板DNA量在20.0～80.0 ng之间时，其扩增条带数量均比较丰富，且亮度高清晰，说明模板DNA量对反应体系影响较小，这与正交设计试验直观分析的结果相符。因此模板DNA量在20.0～80.0 ng均可。

图3模板DNA量对陈山红心杉SCoT-PCR体系的影响Fig.3 The effect of DNA concentration on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

PCR Mix含有dNTP、Mg2+、Taq酶等，这3种试剂对PCR反应体系的影响较大，因此对PCR Mix用量进行优化十分必要。结果显示：随着用量的增加，扩增条带数量、亮度等的综合表现呈现先升后降的趋势，当用量为8.0～11.0μL时，其扩增条带数目较多且清晰明亮，其中PCR Mix用量为9.0μL时最佳（图4）。

表1陈山红心杉SCoT-PCR体系优化正交设计及分析Tab.1 The Orthogonal design L 16(43)and analysis of Redheart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

图4 PCR Mix用量对陈山红心杉SCoT-PCR体系的影响Fig.4 The effect of the amount of PCR Mix on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

此外，引物浓度也是直接影响SCoT-PCR扩增结果的一个重要因素。在8个不同的水平中，随着引物浓度的增加，其扩增效果也呈现出先扬后抑的形式，当引物浓度为0.25～0.50μmol·L-1时，PCR扩增条带较少，且部分条带暗淡不清晰；当其浓度增加至0.75～1.50μmol·L-1时，PCR扩增条明显带增多，且条带的明亮和清晰度也相应提高；而引物浓度持续增加至1.75～2.00μmol·L-1时，PCR扩增条带又出现缺失，因此确定1.50μmol·L-1为引物的最佳浓度（图5）。

图5引物浓度对陈山红心杉SCoT-PCR体系的影响Fig.5 The effect of the concentration primer on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

综合考虑正交设计和单因素优化结果，结合得出SCoT-PCR反应的最优体系为：模板DNA 2.5μL（50.0 ng），PCR Mix 9.0μL，引物3.0μL（即浓度1.5 μmol·L-1），ddH2O补足至20.0μL。以随机选择的20个陈山红心杉DNA为模板，同时随机选取SCoT引物对优化获得的SCoT-PCR反应体系进行检验，结果如图6所示：在该体系下，PCR扩增条带清晰明了，易于判断，多态性较高，这表明该体系稳定性好，通用性强，适用陈山红心杉SCoT分子标记分析。

图6陈山红心杉SCoT-PCR最优体系验证（引物SCoT-35）Fig.6 Verification of the optimal Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system(SCoT-35)

2.4 陈山红心杉SCoT引物筛选

利用优化的SCoT-PCR反应体系进行SCoT引物筛选，经过初筛和复筛，从36条SCoT引物中共筛选获得14条扩增条带丰富明亮且多态性较强的引物，可用于后续陈山红心杉SCoT标记分析（图7）。

图7 SCoT引物的复筛Fig.7 The screening of SCoT primer

3 结论与讨论

SCoT是由Collard和Mackill开发的一种简单新颖的DNA分子标记[3]。本试验采用正交设计与单因素设计相结合的方法对陈山红心杉SCoT-PCR反应体系进行建立和优化，结果获得了适合于陈山红心杉的SCoT-PCR反应体系：模板DNA 2.5μL（50.0 ng），PCR Mix 9.0μL，引物3.0μL（即浓度1.5μmol·L-1），ddH2O补足至20.0μL；而各因素对陈山红心杉SCoT-PCR体系影响顺序为PCR Mix＞引物浓度＞模板DNA，这和耿睿曼等[10]的研究结果类似。PCR Mix含有Taq酶、Mg2+、dNTP等，在PCR反应中，Taq酶是最关键的因素，其浓度过高会引起PCR的非特异性扩增，而过低则会影响PCR扩增效果[11]；Mg2+直接影响Taq酶活性，并且能影响引物与模板DNA的结合，其浓度过高可能会降低PCR扩增的特异性，而过低则影响PCR扩增产量[12]；dNTPs作为PCR反应的底物，当其浓度过高，会影响碱基错配，浓度过低则影响PCR扩增效果[13]。在引物浓度和模板DNA这两个因素中，引物浓度对陈山红心杉SCoT-PCR反应体系的影响较模板DNA对其的影响大。一般PCR反应体系中引物浓度过高则会促使PCR发生非特异性扩增，而浓度过低则影响PCR扩增产量，而模板DNA在其质量得到保障的前提下其对反应的影响较小[14]。

本研究初步建立及优化获得了陈山红心杉SCoT-PCR反应体系，并在其有效的验证基础上利用该反应体系筛选了14条适合于陈山红心杉SCoT标记分析的引物，这为今后利用SCoT分子标记研究陈山红心杉遗传多样性、种质资源鉴定等研究奠定了基础。