结核分枝杆菌来源翻译延伸因子EF-G的蛋白纯化、表征分析及蛋白晶体学研究*

杨 妍 张彦生 姚中达 何润嘉 葛春坡 杨 赟

（新乡医学院基础医学院生物化学与分子生物学系 河南新乡 453003）

蛋白质合成途径中存在着许多潜在的抗生素靶点，其中包括翻译延伸因子（elongation factor，EF-G）[1-2]。作为GTPases 翻译因子家族中的一员，EF-G 具有常见的GTP 酶激活机制及核糖体结合模式[3-4]。 结核病（tuberculosis，TB）是一种由结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的世界性传染性疾病[5]。结核分支杆菌主要攻击人体肺部，同时也会损害身体的其他部位。此外，携带人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的人群患结核病的可能性要高出15～22 倍。

夫西地酸（fusidic acid，FA）是一种应用于临床的抗生素。GTP 水解和易位后，夫西地酸将性糖反应，产生砖红色沉淀。本尼迪特试剂在储藏方面优于斐林试剂，在本实验中也可体现。观察比较未加葡萄糖的斐林试剂组1 号管和本尼迪特试剂组1 号管颜色变化。斐林试剂组1 号管实验开始时含Cu（OH）2蓝色絮状沉淀，之后在高温下逐渐分解产生黑色的CuO 沉淀。而本尼迪特试剂组1 号管在整个实验过程中均呈现蓝色澄清溶液，未发生明显变化。从侧面证明，斐林试剂不耐储藏，EF-G 固定在核糖体复合物上[6]。已有研究表明，夫西地酸对结核病具有抑制作用[5]。因此，结核分支杆菌对夫西地酸的敏感性一直是研究热点。

来源于结核分支杆菌的EF-G 基因与大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜热杆菌（Thermus thermcphilus）和金黄色葡萄球菌（Staphylcoccus aureus）的同源物的序列一致性较高，分别为59.2%、61.2%和61.3%。目前已对大肠杆菌（PDB：1JQM）、嗜热菌（PDB：1PN6）和金黄色葡萄球菌（PDB：3ZZ0）来源的EF-G 进行了相应的结构分析。然而，有关结核分枝杆菌来源于EF-G 的结构研究报道却很少。对结核分枝杆菌来源的EF-G 的结构分析将有助于在FA 的基础上研发治疗结核病的新型药物。

在本研究中，报道了EF-G 的蛋白纯化、结晶和表征分析，为利用基于结构的药物设计开发新型抗结核药物提供帮助，并阐明分离出的耐FA结核分枝杆菌中关键氨基酸的精确定位。

1 材料与方法

1.1 质粒构建、蛋白表达及纯化 利用Genewiz密码子优化技术合成编码结核分枝杆菌EF-G 的核苷酸序列（UniProt Access Number P9WNM7），并将其插入到pSMT28 载体（改良的6×His-SUMO pET28b+载体）中构建成质粒，将该质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 中。使用含50 μg/mL 氯霉素、100 μg/mL 卡那霉素的LB 培养基，37°C、200 r/min 培养细胞。在37℃培养条件下，待LB 培养基中细胞培养物的OD600达到0.6～0.8 时，加入IPTG 使其终浓度为0.5 mmol/L，在20 ℃条件下作用20 h 以诱导蛋白表达。

以8 000 r/min、离心15 min 后收集细胞。随后加入裂解液30 mL 重悬细胞，该裂解液含有：50 mmol/L Tris（pH=8.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、2 mmol/L BME。使用高压匀浆机（1 000 bar）破碎细胞壁后，在4℃、18 000 r/min 条件下离心1 h 以清除细胞碎片。将上清液装入HisTrap HP柱上，分别添加50 mmol/L 咪唑和250 mmol/L 咪唑的裂解缓冲液中洗脱蛋白。经SDS-PAGE 电泳分析后，使用Ulp1 酶对洗脱蛋白进行酶切，去除6×His-SUMO 标签。

使用Superdex 200 16/600 色谱柱浓缩样品后，将样品再次装入HisTrap HP 柱，用分别添加50 mmol/L 咪唑和250 mmol/L 咪唑的裂解缓冲液洗脱蛋白后，采用分子筛纯化后用超滤管对蛋白进行浓缩。使用Bradford 法测定蛋白浓度，并利用12% SDS-PAGE 分析样品纯度。

1.2 蛋白结晶 将蛋白质浓缩至约20 mg/mL。在晶体筛选实验前，将样品在4℃、12 000 r/min，条件下离心10 min 澄清样品。采用坐滴式蒸汽扩散法在96 孔板上进行初筛，通过蛋白质浓度、pH 值或沉淀剂浓度的变化对初始条件进行修正。

1.3 X 射线衍射数据采集与处理 通过上海同步辐射装置（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）的BL17U 光束线采集得到X 射线衍射数据，波长为0.09793 nm。晶体到探测器的距离为350 mm，曝光时间为1 s/帧，振荡范围为1.0°。晶体采集分辨率为0.32 nm。使用HKL-2000 对原始衍射数据进行索引、整合、缩放和合并。

1.4 小角X 射线散射数据采集与处理 在4℃、12 000 r/min 条件下离心10 min 以澄清样品。在上海同步辐射装置（SSRF）的BL19U2 光束线上采集得到小角X 射线散射（small-angle X-ray scattering，SAXS）数据。在20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）、100 mmol/L NaCl 缓冲液中制备样品，浓度为0.75～3 mg/mL。从3 组20 张图像中整合并平均得到结果数据，并使用缓冲帧以消除背景。采用间接傅里叶变换方法估算颗粒的回转半径（Rg），由最大维数Dmax计算颗粒P（r）的对分布。

2 实验结果与分析

2.1 重组EF-G 的纯化 使用SUMO 标签蛋白增加蛋白质的可溶性表达[7-8]。将EF-G 基因插入到pSMT28 载体中。随后，将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞内，以获得高表达的6×His-SUMO标签融合蛋白，分子量约为91 kDa（图1A）。

图1 蛋白表达及纯化

经镍亲和层析获得大量的可溶性重组蛋白。使用SUMO 特异性蛋白酶Ulp1，去除6×His-SUMO 标签[9]。经第2次Ni-NTA 层析得到的无标记蛋白的分子量约为77 kDa，与理论分子一致（图1B）。然后，用凝胶渗透色谱法对纯度较高的EF-G 进行纯化，在79 mL 处出现一个峰洗脱（图1C）。所有纯化步骤用12 % SDS-PAGE 检测。

2.2 结晶和X 射线的初步分析 在不同的结晶条件下（表1），EF-G 在3～4 周内出现小晶体（图2）。

表1 结晶条件

图2 蛋白结晶

通过改变沉淀剂浓度、蛋白质浓度、缓冲液pH 值和添加剂，对结晶条件进行了优化。在JCSG+A3［0.2 mol/L 柠檬酸三铵，22%（W/W）PEG3350］的优化条件下，可得到较大的晶体。X 射线衍射数据是从单晶中进行收集，最高分辨率为0.383 nm（图3B）。EF-G的数据收集和统计处理如表2所示。空间群属于P61，晶胞参数a=26.079 nm，b=26.079 nm，c=6.28 nm；α=β=90.00°，γ=120.00°。

图3 X-射线衍射数据采集与处理

表2 初步x 射线晶体学研究

2.3 SAXS 分析 使用SAXS 方法检索EF-G 在溶液中的分子形状。根据吉尼耶图（Guinier plot）计算得到回转半径（Rg）为3.649 nm。而距离分布函数P（r），则由最大距离计算得出为13.03 nm。根据P（r）确定的回转半径（Rg）为3.667 nm，与Guinier分析计算的Rg相近似（图4A～4C）。SAXS 实验结果表明，EF-G 在溶液中形成了相对刚性的结构。

图4 SAXS 分析

3 讨论

来源于大肠杆菌[10]、嗜热链球菌[11]及金黄色葡萄球菌[12]EF-G 的结构揭示了其在蛋白质合成中的作用机制。虽然结核分枝杆菌来源的EF-G与其同源物的序列一致性很高，但有关结核分枝杆菌来源EF-G 的结构尚未见报道。本研究收集了EF-G 的X 射线散射数据。目前，正在尝试以金黄色葡萄球菌来源的EF-G（PDB：2xex）的结构作为搜索模型[12]，采用分子置换（molecular replacement，MR）方法进行测定。

此外，关于目标蛋白质的三维结构尚未明确，其相关检测目前也正在进行。本实验室将在这方面进行进一步的研究。SAXS 实验是一种提取溶液中蛋白质分子形状的方法[13-14]。经SAXS 分析表明，EF-G 在溶液中为致密结构蛋白。除此之外，EF-G 还可作为一个药物靶点[1]。因此，对EFG 结构的分析将为抗结核病新药的开发奠定重要的理论基础。