电针对慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆及海马区氨基酸类神经递质和其受体的影响

吴建丽,张良,刘双岭,贾坤平,朱紫薇,付新,陆阁玲,孙忠人

（1.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学第二临床医学院,哈尔滨 150040）

睡眠对人类记忆形成和巩固具有重要的生物学作用[1],随着生活方式的改变和多重压力的增大,各种原因引起的睡眠时间减少或睡眠质量下降已成为生活中常态,医学上将机体每日总睡眠时间少于 4 h超过 3个月以上的状态称为慢性睡眠剥夺（chronic sleep deprivationm,CSD）。研究显示睡眠不足能够导致机体注意力、记忆力及执行力下降,使大脑变得迟钝[2],还能抑制β淀粉样蛋白的代谢加快阿尔兹海默病的发病进程[3]。认知水平下降虽不危及生命,却严重影响学习和工作效率,降低日常生活质量。然而目前CSD引发认知障碍的发病机制尚不明确,且缺乏有效的防治手段。针灸是中医学中的特色外治疗法,在治疗失眠、抑郁等神经功能性疾病方面有显著的临床疗效[4]。课题组前期研究[5]表明,电针可能通过调节脑内单胺类神经递质的平衡而恢复睡眠觉醒周期。本研究将进一步观察电针对 CSD发生后学习记忆能力的影响,并通过海马内谷氨酸（glutamate,Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）神经递质含量及 N-甲基-D-天冬氨酸受体（n-methyl-D-aspartate receptor,NR）亚基 NR2A、NR2B的变化,初步探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级Wistar大鼠24只,雄性,6～7周龄,体质量（190±10） g,购自黑龙江中医药大学药物安全评价中心,许可证号[SYXK（黑）2016004]。在黑龙江中医药大学针灸研究所实验室饲养,温度（22～24） ℃,相对湿度50%～70%,自由摄食和饮水,适应性饲养1周后进行实验。本实验对动物的处置符合科技部颁发的《关于善待动物的指导性意见》。将筛选出的24只大鼠按体质量大小编号,用SPSS24.0软件生成随机数字进行分组,分为大平台对照组（tank control,TC）、模型组（model,M）和电针组（Electro-acupuncture,EA）,每组8只。

1.2 主要仪器和试剂

微电流刺激仪（美国 BioMedical Life System）,Morris水迷宫（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）,睡眠剥夺箱（自制）,大鼠 Glu ELISA试剂盒（ml037094-1,上海酶联生物研究所）,大鼠 GABAELISA试剂盒（ml003128-1,上海酶联生物研究所）,RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、上样缓冲液、彩色预染Maker、封闭液、一抗二抗稀释液及超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术公司）,NMDAR2A Rabbit Polyclonal抗体（28571-1-AP,美国 Proteintech公司）,GRIN2B Rabbit Polyclonal抗体（21920-1-AP,美国Proteintech公司）,GAPDH（10494-1-AP,美国Proteintech公司）,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H＋L）（SA00001-2,美国Proteintech公司）,PVDF膜（美国Millipore）。

1.3 模型制备

采用改良的多平台水环境法建立 CSD模型[6]。将造模大鼠置于睡眠剥夺箱内进行异相睡眠剥夺,箱体大小为100 cm×60 cm×50 cm,内部固定直径为6.5 cm的圆形小平台共8个,平台间距15 cm,高8 cm,箱体内注入自来水,水面在平台下约 1.0 cm。距平台上方约15 cm处用铁丝网遮盖并放置食物和水瓶。正式实验前将大鼠置于睡眠剥夺箱适应 5 d,每日 1次,每次2 h。造模时,给予24 h日光灯照射,每日16:00至次日10:00进行睡眠剥夺18 h,然后恢复睡眠6 h,连续睡眠剥夺21 d形成模型,其中大平台对照组睡眠剥夺箱内的平台上放置一张细密的铁丝网,确保大鼠在相似的水环境内可以自由活动和睡眠。造模成功标准为大鼠表现为活动减少,精神疲惫,反应迟钝,大量脱毛及体质量减轻的症状,水迷宫检测逃避潜伏期成倍的延长,穿越平台次数成倍减少。

1.4 干预治疗

电针组选取双侧风池和供血穴进行治疗,参照大鼠穴位图[7]和项部腧穴神经解剖结构[8],结合比较解剖学方法进行定位。风池穴位于大鼠天门穴（即枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处）旁开约2 mm;供血穴位于风池穴直下约 0.5 cm,相当于第 4颈椎棘突旁 2 mm。采用0.16 mm×7 mm毫针从项部向鼻尖方向刺入3～4 mm,针柄连接微电流刺激仪,正极在上,负极在下,刺激频率2 Hz,电流强度0.5 mA,连续疏波刺激,以大鼠无躁动、项部肌肉轻微收缩为度,刺激20 min,每日1次,连续治疗14 d。大平台对照组和模型组给予相同时间和方式的捆绑固定,但不进行治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 水迷宫测试

干预后分别进行定位航行和空间探索测试以评价大鼠空间学习记忆能力。实验在隔音、较暗的环境进行。水迷宫由直径为1.5 m的圆形水池和直径10 cm、高15 cm的平台组成,正上方安装有摄像头。实验前将水池注入温水,加入墨汁,平台低于水面约2 cm。定位航行实验将平台固定在第Ⅳ象限,将大鼠分别从 4个象限固定一点面向池壁放入水中,若90 s内找到平台则在上面停留10 s,若90 s内未找到平台则引导至平台并停留10 s,如此训练5 d,每次大鼠找到隐藏在水下平台的时间即为逃避潜伏期（escape Latency,EL）。空间探索实验在第 5天定位航行测试后,将平台移走,2 h后将各组大鼠固定从第Ⅱ象限放入水中,记录90 s内穿越平台的次数（transition,T）。

1.5.2 ELISA检测Glu和GABA的含量

取脑组织后在冰上迅速剥离海马,然后置于液氮中速冻,冰浴下匀浆至组织完全裂解,4 ℃,12000 r/min离心10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱待测,按照相关ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.5.3 Wb法检测海马内NR2A、NA2B蛋白表达

取1.5 mLEP管,依次加入海马组织、RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂,比例为1:10:1,冰浴裂解15 min,然后用组织研磨器冰上研磨 2 min,3000 r/min离心10 min,小心吸取上清液至已标号的EP管内。按照BCA试剂盒说明,用酶标仪于562 nm波长下测定样本上清液的吸光度,计算出总蛋白的浓度,并对所有样本的总蛋白浓度进行配平,加入上样缓冲液后高温煮沸5 min,室温晾凉后备用。经凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭室温 1.5 h、一抗室温孵育 1.5 h（NR2A稀释1:500,NA2B稀释1:1 000）、二抗室温孵育45 min（稀释1:10 000）,加入ECL发光液曝光。用Image J分析软件将条带灰度值数字化,目的蛋白与内参 GAPDH的灰度比值代表相对表达量。

1.6 统计学方法

用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示,符合正态分布数据多组间比较采用one-way ANOVA分析,方差齐组间均数两两比较用LSD检验;若方差不齐则采用Tamhane's T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况观察

造模后,M组和EA组大鼠反应迟钝懒动,眯眼弓背蜷缩,精神疲惫,毛发严重脱落失去光泽,易惊恐和被激惹,有相互撕咬导致脚趾、尾部破损出血的现象,摄食饮水量下降,大便稀臭,体质量减轻;TC组大鼠则表现正常。14 d干预后,EA组大鼠反应灵敏,自主活动增多,有警惕性,毛发脱落较少有光泽,进食量逐渐增多,体质量缓慢增加,而M组大鼠则反应迟钝、活动量少和容易被激惹。

2.2 各组大鼠空间学习记忆能力的变化

随着训练次数增加,各组大鼠寻找水下平台所需的时间逐渐缩短。与TC组比较,M组每日的逃逸潜伏期（EL）明显延长,差异有统计学意义（P＜0.01）,且第5天穿越平台次数（T）亦有显著的差异（P＜0.01）。与M组比较,第5天时EA组EL明显缩短,T显著增多,差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见图1。

图1 各组大鼠空间学习记忆能力的比较

2.3 各组大鼠海马Glu、GABA含量的变化

结果显示与TC组比较,M组大鼠海马Glu含量明显减少,GABA含量明显增多,Glu/GABA比值显著降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;与M组比较,EA组大鼠海马Glu含量增多,GABA含量降低,Glu/GABA比值显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）,详见表1。

表1 各组大鼠海马内氨基酸类神经递质含量的比较（±s）

表1 各组大鼠海马内氨基酸类神经递质含量的比较（±s）

注:与TC组比较1）P＜0.01;与M组比较2）P＜0.01

组别 n Glu（mg/L） GABA（μmol/L） Glu/GABA TC组 8 76.99±4.68 4.01±0.48 19.52±3.27 M 组 8 53.84±5.931） 5.59±0.621） 9.75±1.661）EA组 8 71.16±4.432） 4.26±0.482） 16.79±1.202）

2.4 各组大鼠海马NR2A、NR2B蛋白表达的变化

Wb结果表明,与TC组比较,M组大鼠海马区NR2A和NR2B蛋白相对灰度值明显下降,差异有统计学意义（P＜0.01）。与 M组比较,经电针治疗后,海马区 NR2A和 NR2B蛋白表达均明显增加,差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.05）,详见图2。

图2 各组大鼠海马区谷氨酸受体NR2A、NR2B蛋白表达水平（±s,n＝6）

3 讨论

针灸治疗失眠已得到国内外医学界的广泛认可[9],临床实践发现针刺不但能恢复睡眠功能,对睡眠不足引发的认知损伤也有很好的改善作用[10]。风池穴是胆经要穴,又为少阳经与阳跷脉的交会穴,针刺风池穴既可疏调胆气有安神定惊的作用,又可通过调理跷脉而平衡阴阳,从而治疗失眠。供血穴为颈夹脊穴,位于督脉与膀胱经之间,此二经均上行入脑,针刺供血穴可通过刺激二经起到开窍益智、镇静醒脑之功。现代研究[11]也表明,风池和供血穴可促进椎-基底动脉血液循环而改善脑功能,还能调节脑干网状结构恢复大脑皮质兴奋与抑制平衡,活化脑细胞,从而恢复睡眠-觉醒周期。

睡眠有助于记忆形成,学习也影响着睡眠结构[12]。睡眠周期中,快速眼球运动睡眠（rapid eye movement sleep,REMs）在记忆形成和巩固中发挥着重要作用。有学者[13-14]报道,学习强度越大、频率越高,REMs出现越早,在睡眠周期中所占比例也显著增多,当剥夺REMs后,学习能力则明显下降。本研究发现,与TC组相比,M组大鼠EL明显延长,T显著减少,说明CSD后即使恢复大鼠正常睡眠,认知功能也未能完全恢复;经治疗后,EA组EL较M组明显缩短,T显著增多,说明在既往证明电项针改善睡眠功能的基础上,本次实验也明确了电项针能提高CSD后学习记忆能力的作用。

学习记忆是脑的高级神经功能,是脑神经元对信息获取、编码、存储和提取的复杂过程,突触是保证这一过程顺利完成的重要结构。Glu是突触传递的兴奋性递质,其释放后可与突触后膜上 NR受体结合,促进钙离子内流维持长时程增强,从而提高记忆能力。NR2A和NR2B是NR受体的两个调节亚基,与学习记忆的关系最为密切,NR2B甚至被称为“记忆基因”[15]。有研究[16-17]报道,促进NR2A或NR2B过度表达可使小鼠学习记忆明显提高,反之,抑制表达则学习能力明显受损。GABA是脑内的抑制性递质,能降低大脑兴奋性而抑制突触传递。研究表明Glu/GABA比值过高会产生细胞毒性作用,导致神经元受损出现认知障碍,而比值过低也会抑制突触可塑性形成和记忆的存储[18]。本研究中,与TC组比较,M组海马Glu含量、Glu/GABA比值、NR2A和NR2B表达明显降低,GABA含量上升,表明了慢性睡眠剥夺后Glu和GABA的浓度失衡,谷氨酸受体减少导致了突触传递效率下降,从而造成记忆损害。经电针治疗后,大鼠Glu、GABA、Glu/GABA、NR2A和NR2B受体表达水平较M组均明显改善,说明电项针能恢复Glu/GABA的分泌平衡,上调NR2A和NR2B的表达而改善记忆功能。

综上所述,电针具有提高慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的作用,其机制可能与调节海马内 Glu/GABA的分泌平衡,上调谷氨酸受体亚基NR2A和NR2B受体的表达水平,诱导和维持长时程增强效应,提高突触可塑性有关。